真菌特有异戊烯炔型杂萜的生物合成机制研究

Acetylenic prenyl chain-type meroterpenoids are exclusively derived from fungi, which exhibit a range of biological activities. Despite the demonstration of carbon-carbon triple bonds in acetylenic fatty acids, the biosynthesis of alkynyl in other acetylenic natural products remains to be elucidated. In our previous study, we isolated a series of acetylenic prenyl chain-type meroterpenoids represented by biscognienyne B from Biscogniauxia sp., which provides us an opportunity to elucidate the biosynthetic mechanism of acetylenic prenyl chain. Then, we sequenced the genome of Biscogniauxia sp., and found the putative biosynthetic gene cluster for biscognienyne B. In this project, we will screen a liquid fermentation condition in which the major product is biscognienyne B and establish the Biscogniauxia genetic manipulation system, and then via the efficient gene knock-out method based on CRISPR/Cas9 technology and Aspergillus oryzae heterologous expression system, we will try to unravel the biosynthetic pathway for biscognienyne B, so as to decipher the formation of alkynyl in acetylenic prenyl chain, which will enrich the knowledge on the fungal secondary metabolism and provide a new tool for using biosynthetic approaches to generate acetylenic compounds.

异戊烯炔型杂萜是一类真菌特有，且具多样生物活性的炔类天然产物，属非脂肪酸类炔。目前人们仅对脂肪酸类炔的生物合成有所研究，而非脂肪酸类炔的生物合成研究尚属空白。我们前期发现一株炭皮真菌富含异戊烯炔型杂萜，并从中分离获得了一系列以Biscognienyne B为代表的异戊烯炔型杂萜类新颖结构，这为我们开展异戊烯炔的生物合成研究提供了难得的素材。对该菌株，我们已完成了其全基因组测序，并通过同源基因找到了Biscognienyne B潜在的生物合成基因簇。本项目拟建立富产Biscognienyne B的液体发酵条件以及炭皮真菌的遗传操作系统，利用CRISPR/Cas9基因敲除法和米曲霉异源表达体系，阐明Biscognienyne B生物合成途径，以此解析异戊烯炔的形成机制，为其他非脂肪酸类炔的生物合成研究提供借鉴。本项目不仅能拓展对真菌次生代谢的认识，也可为天然产物的炔基改造提供新的酶催化工具。

炔基是许多药物、活性天然产物以及功能材料等的重要官能团，开发高效的炔类化合物合成策略具有重要意义。传统的合成策略包括通过化学反应直接制备，或以简单的炔类前体为底物，通过生物转化获得。随着合成生物学技术的飞速发展，从头生物合成有望成为炔类化合物合成的新策略。该策略绿色环保，易于操作，是对传统化学合成以及生物转化策略的有效补充，其实施的关键是阐明天然产物中炔基的生物合成机制，获得炔基合成酶。自然界中存在大量不同类型的炔类天然产物，包括脂肪酸类、聚酮类、氨基酸类、杂萜类等，而且炔基在同一类天然产物中的位置也各不相同，提示可能存在多种炔基形成机制。目前，研究人员仅阐明了脂肪酸中的炔基以及氨基酸中的末端炔基的形成机制。真菌中含有一类特有的杂萜化合物，它们的异戊烯链中包含有一个炔键单元，我们称这类杂萜为异戊烯炔型杂萜，这类化合物的炔键形成机制仍不清楚。前期，本课题组从一株炭皮属真菌（Biscogniauxia sp. 71-10-1-1）中分离鉴定了异戊烯炔型杂萜Biscognienyne B。我们对目标菌株进行了全基因组测序，然后通过同源查找，筛选获得了一个候选的Biscognienyne B生物合成基因簇。利用米曲霉异源表达体系，我们阐明了Biscognienyne B的生物合成途径，发现异戊烯炔型杂萜的炔基是由P450酶BisI催化形成的。为了深入了解BisI催化炔基形成的机制，我们又开展了底物喂养实验，结果显示BisI可以催化异戊烯链脱氢形成具有(E)-1,3-diene结构的中间体，但无法进一步催化反式双键脱氢形成炔基。此外，我们还发现BisI对底物中异戊烯链的长度没有严格的要求，可识别连有C5或C15异戊烯链的底物。综上，在本项目中，我们首次阐明了异戊烯炔型杂萜的生物合成机制，发现了一类新的炔基合成酶，为利用合成生物学技术合成炔基提供了潜在的酶工具。