褪黑素通过Wnt/β-catenin/c-Myc通路调控HXK2表达及其与线粒体结合参与糖尿病创口愈合的机制研究

Diabetic non-healing skin ulcers has become one of the challenges in clinical therapy, and the decrease in the ability of angiogenesis due to endothelial dysfunction plays a decisive role in it. In the previous study, we’ve demonstrated that melatonin could protect vascular endothelium from high glucose induced injury via Wnt/β-catenin pathway. We further proved that melatonin mediated vascular protection is associated with its role in increasing the level of Wnt/β-catenin downstream factor c-Myc in vascular endothelial cells, which further increased the expression of HXK2 and promoted the combination of HXK2 with mitochondria, and then inhibited mitochondria-dependent apoptosis. However, the mechanism remains to be further explored. Based on the previous studies, we will firstly change the expression level of c-Myc in vascular endothelial cells by siRNA interference and virus transfection, thus confirming the role of c-Myc in melatonin mediated endothelial protection in cells and animal models. Secondly, we will delete HXK2 or interfere with the combination of HXK2 with mitochondria by genetically modifying HXK2 in cultured endothelial cells. And at last, we will use vascular endothelial specific HXK2 knockout mice and the N terminal deficiency HXK2 mice (△N-HXK2), to finally confirm the critical role of HXK2 and its mitochondria co-localization in melatonin mediated endothelial protection under hyperglycemia condition both in cultured endothelial cells as well as diabetic skin trauma models. This project will hopefully provide new targets for the prevention and treatment of diabetic vascular complications.

糖尿病难愈性皮肤溃疡是临床上亟待解决的难题，内皮功能障碍导致血管生成能力下降被认为是造成糖尿病溃疡难愈的重要因素。我们前期研究证实褪黑素（Mel）通过Wnt/β-catenin通路促糖尿病血管修复，并初步证实该效应与上调血管内皮细胞c-Myc水平，增加HXK2表达及其与线粒体结合，进而抑制线粒体途径依赖的凋亡相关，但该机制有待进一步确证。基于前期研究基础，我们将首先通过基因干扰使c-Myc缺失，在细胞及动物层面确认c-Myc在Mel促高糖损伤血管内皮细胞修复过程的作用；其次在细胞水平通过基因干扰或过表达手段，改变HXK2在血管内皮细胞的表达并干扰其与线粒体结合；最后使用血管内皮特异性HXK2基因敲除小鼠及HXK2 N端缺失（△N-HXK2）小鼠，在细胞及糖尿病皮肤创伤模型中确认HXK2及其线粒体定位在Mel促糖尿病血管内皮细胞修复过程的作用。本项目有望为糖尿病难愈性皮肤溃疡防治提供新靶点。

糖尿病等疾病会导致慢性非愈合伤口长期处于炎症期，伤口微环境中的细胞表现出促炎和抗炎因子的失调和血管生成受损。创面内的成纤维细胞表现出细胞外基质合成减少，细胞的迁移和增殖能力下降，阻止肉芽组织形成，导致伤口无法正常愈合。成纤维细胞是参与肉芽组织形成的关键细胞类型，对有效的伤口愈合至关重要。褪黑激素（Melatonin）是一种高度保守的古老分子，在皮肤的保养中起着至关重要的作用。由于人类皮肤具有功能性褪黑激素受体，并拥有能够产生和调节褪黑激素合成的完整系统，因此，Melatonin是维护和保护皮肤状态的一个有前途的候选者。作为一种强效的自由基清除剂，Melatonin能够通过提供一个电子来中和活性物质。与经典抗氧化剂不同，Melatonin缺乏促氧化活性，而其与活性物质相互作用产生的所有已知中间体都是自由基清除剂，被定义为褪黑激素家族的自由基清除级联反应。由于这种级联，一个Melatonin分子有能力清除多达四种或更多的活性物质。然而，到目前为止，Melatonin在包括糖尿病在内的慢性皮肤创面中所扮演的角色仍知之甚少。在此项研究中，我们分别在db/db小鼠皮肤创伤模型和Age培养的HDF中证实：Melatonin在体内实验中可显著增加db/db小鼠皮肤创口的肉芽组织从而促进创伤愈合；Melatonin在体外实验中能够显著促进HDF的“伤口”愈合。同时，体内体外实验均证实，Melatonin可促进成纤维细胞的增殖，并抑制其向肌成纤维细胞的分化及炎症反应。其中，转录组测序结果发现Melatonin发挥改善创伤愈合效应与其调控TNC和IL-10相关。随后我们通过敲除和敲入手段分别在Age培养的HDF和db/db小鼠皮肤创伤模型中证实TNC与IL-10是Melatonin发挥改善创伤愈合效应的关键靶基因。综上所述，本实验结果显示，Melatonin可通过TNC与IL-10介导的促成纤维细胞增殖并抑制炎症和分化从而发挥改善创伤愈合效应。本研究有望为糖尿病创伤提供一定的理论参考及临床治疗思路，并有望开辟Melatonin治疗包括糖尿病创伤在内的慢性难愈性创伤的新篇章。