翻译后修饰IFITM3膜蛋白的化学合成及其抗病毒活性调控机制

Interferon-induced transmembrane protein 3 (IFITM3) restricts cellular infection by multiple important viral pathogens. The antiviral activity of the small transmembrane protein (133 amino acid) is controlled by at least four distinct post-translational modifications (S-palmitoylation, lysine ubiquitination, lysine methylation and tyrosine phosphorylation). Further studies of the influence of posttranslational modifications on antiviral activity require for efficient methods to provide the homogeneous IFITM3 material containing site-specifically posttranslational modifications. In this project, the combinations of chemically selective ligation reaction, covalent cross-linking, mass spectrometry, liposome membrane fusion and engineering hybrid exosomes will be performed to achieve the following goals: (1) the efficient preparation of post-translationally modified IFITM3 protein samples and their probes; (2) the discovery and identification of specific interacting proteins of the modified IFITM3; and (3) the interpretation of the dynamic regulatory mechanism of post-translational modification for the antiviral activity.

干扰素诱导的跨膜蛋白质3（Interferon-induced Transmembrane Protein 3,IFITM3）具有重要的抗病毒感染的能力。 IFITM3是含133个氨基酸的小膜蛋白质，它的抗病毒活性通过棕榈酰化、泛素化、磷酸化和甲基化等至少四个不同的翻译后修饰来调控。为进一步研究这些翻译后修饰的抗病毒活性机理，需要发展定点翻译后修饰IFITM3蛋白样品的高效获取方法。本项目将以高选择性化学连接反应为技术手段，结合共价交联、质谱分析、脂质体融合及人工设计外泌体技术等，实现的目标包括：（1）高效制备定点翻译后修饰的IFITM3 蛋白样品及其探针；（2）发现鉴定特异性相互作用蛋白；（3）阐释翻译后修饰的动态调控过程的作用机制。

干扰素诱导的跨膜蛋白（Interferon-induced Transmembrane Proteins, IFITMs）是一类具有广谱抗病毒能力的蛋白质。其中IFITM3的抗病毒能力最强，作用范围最广，能够抑制多种病毒入侵和复制，包括 HIV-1、DENV、EBOV和Zika 等。IFITM3的翻译后修饰（S-棕榈酰化（S-Palm）、泛素化、磷酸化和甲基化等）能够调控抗病毒活性，但翻译后修饰对IFITM3的抗病毒活性调控的机理仍然不明确。为此，需要获取特定位点修饰的IFITM3蛋白样品，用于相关生物化学、生物物理及生物医学研究。但是，高效获取定点翻译后修饰IFITM3膜蛋白依然十分困难。以S-棕榈酰化的IFITM3合成为例，通过生物方法难以获得均一样品。化学方法获取该修饰蛋白也存在挑战，这是因为两方面原因：首先，S-Palm膜蛋白极为疏水，合成操作过程困难；其次，S-Palm修饰的硫酯键非常活泼，与自然化学连接（NCL）等反应条件不兼容。.为此，本项目发展了基于新型自环化酚羟基保护基γ-氨基丁酸(GABA)的可移除骨架修饰策略(RBMGABA)辅助的丝/苏氨酸连接(Removable-Backbone-Modification Assisted Ser/Thr Ligation, RBMGABA-assisted STL) 技术，使用该技术实现了S-Palm跨膜肽片段的高效连接。同时，发展了一种新的 1,3-丙二硫醇（1,3-Propanedithiol，PDT）保护的水杨醛(Salicylaldehyde，SAL)酯（SALPDT）结构，该结构与NCL反应条件兼容，且在NCL反应结束后可活化为有STL反应活性的SAL-酯。基于此，我们开发了N-to-C 顺序的 NCL 和 STL 结合策略(NCL-STL)，实现了133个氨基酸的S-Palm IFITM3膜蛋白的顺利获取。利用新策略，我们成功地实现了S-Palm IFITM3样品的制备。新的RBMGABA-assisted STL) 技术和NCL-STL组合连接策略为获取更大、更复杂的多翻译后修饰IFITM3及其探针提供了有效途径，进一步探索S-Palm 修饰及去修饰的IFITM3相互作用蛋白、S-Palm与其他翻译后修饰之间的相互影响以及解析S-Palm IFITM3膜蛋白结构提供了研究工具。