两栖类皮肤膜活性肽α-MAPs选择性阻抑乳腺癌MCF-7细胞生长的分子机制研究

膜活性多肽α-MAPs能选择性作用于恶性肿瘤细胞系特别是多药耐药肿瘤株，对正常细胞无毒，具有传统抗肿瘤药物无可比拟的优点。但对其作用机制研究一直局限于α-MAPs利用两亲性α-螺旋结构作用于肿瘤细胞膜，并在细胞质膜上形成通道，导致细胞内物质外泄而造成细胞死亡。有研究证明两栖类皮肤α-MAPs除了可以利用正负电荷作用于肿瘤细胞膜形成膜通道以外，还诱导肿瘤细胞凋亡。本研究在对十多种两栖类α-MAPs结构和功能研究的基础上，选择两种有代表性结构的α-MAPs，从细胞膜结构和形态、细胞膜受体、细胞内细胞器以及细胞凋亡途径相关酶和凋亡因子活性和表达等方面系统研究α-MAPs抑制肿瘤细胞生长或杀死癌细胞的途径及作用的分子机制，探讨α-MAPs对细胞膜作用以外的作用机制，阐明α-MAPs诱导癌细胞凋亡的主要途径及诱导凋亡的分子生物学机制，探讨α-MAPs作为新型抗癌药物的可行性并提供理论依据。

膜活性多肽α-MAPs（α helix membrane-active peptides）是一种广泛存在于生物体中的一类小分子生物活性肽，通常比较短，具有两亲性结构，带有正电，具有较好的抗菌活性和抗癌活性。其中具有抗癌作用的膜活性多肽可以选择性地作用于癌细胞，对正常细胞损伤较小，对人体几乎不具有毒性作用，且不易产生耐药性，因此有望发展成为新型的抗癌药物。但目前对α-MAPs抑制肿瘤细胞生长的途径和分子机制还缺乏充分的理解。.两栖类动物膜活性多肽一般均为疏水的、带正电荷的并且以一种两亲性的α-螺旋的构象存在，这种结构可以促进与膜的相互作用能力，通过对癌细胞膜、细胞骨架、线粒体、细胞核等结构的入侵达到抗癌的作用效果。本项目研究的膜活性多肽temporin-1CEa是从中国林蛙皮肤分泌物中提取获得的一种阳离子α-MAPs，由17个氨基酸组成，其中含有9个疏水性氨基酸和7个亲水性氨基酸，具有较好的两亲性。本研究在前期工作基础上，对temporin-1CEa的抑癌作用的选择性、作用规律和作用方式进行了深入研究，重点探讨了temporin-1CEa的生物膜损伤机制、作用靶点及其相关细胞内机制。我们首先检测temporin-1CEa对不同癌细胞和正常细胞的作用，确认该肽的抑癌规律及其在发挥抑癌活性时是否具有选择性；然后通过细胞凋亡和细胞毒检测结合透射电镜形态观察探讨temporin-1CEa诱导乳腺癌MCF-7细胞死亡的途径和方式；接下来通过扫描电镜形态观察以及细胞膜电位和膜通透性的检测考察temporin-1CEa对乳腺癌MCF-7细胞细胞膜的损伤情况；最后采用荧光标记肽FITC-temporin-1CEa分析了该肽在MCF-7细胞中的作用靶点和部位，并从线粒体膜电位、细胞内游离钙浓度和活性氧水平以及DNA结合等几个方面探讨了temporin-1CEa在MCF-7细胞内部的作用机制。以上研究为α-MAP型膜活性多肽抗癌作用机制的阐明，深入探究多肽与膜相互作用的规律提供实验依据，对于今后更有针对性地开发和设计高效低毒的新型抗肿瘤药物分子具有重要的意义。