玉米骨干亲本08-641淀粉合成过程中AGPase酶磷酸化调控分子机制

Maize starch synthesis is completed by a series of enzymatic catalysis, of which ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) is a key rate-limiting enzyme in starch synthesis in maize. AGPase enzyme activity directly determines the yield of maize starch. Studies show that phosphorylation of AGPase may be a key regulation to its activity, however, how to effect its activity and synthesis of starch is still unknown. Our proposal is aimed to invistigate the effect of AGPase phosphorylation on its activity and the distribution law of AGPase phosphorylation in the process of starch synthesis with approaches of biochemistry, molecular biology, phosphopreteomics and enzyme kinetics in the high starch inbred line 08641 which is widely used in the southwestern region. These studies will provide the theoretical basis for targeting modification of AGPase enzyme and lay the foundation for further molecular improvement on inbred line 08-641.

玉米淀粉合成由一系列酶催化完成的，其中二磷酸腺苷葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）是玉米淀粉合成的关键酶限速酶。其活性高低直接决定玉米淀粉的产量。研究表明磷酸化调节可能是AGPase活性的关键调节方式，但如何影响其活性和淀粉的合成还不清楚。本申请以西南地区广泛应用的高淀粉骨干自交系08641为研究对象，综合运用生化与分子生物学、磷酸化蛋白质组学、酶动力学方法，研究淀粉合成过程中，AGPase磷酸化对其活性影响及在淀粉合成过程中的变化规律。为靶向改造AGPase酶提供理论依据及骨干自交系08-641进一步分子改进奠定基础。

在玉米淀粉生物合成中，AGPase催化一个关键的限速步骤，将ATP和G-1-P转化为ADP葡萄糖和二磷酸。以往的研究表明，AGPase受氧化还原、热调节和变构调节。然而，在玉米淀粉生物合成阶段，AGPase的磷酸化尚不清楚。phos-tag技术是一种利用phos-tag分离、纯化和检测磷酸化蛋白的新方法。项目通过克隆AGPase大小亚基基因，构建原核表达载体，诱导并纯化大小亚基蛋白，免疫新西兰大白兔，制备Sh2和Bt2多克隆抗体。用Phos-tag富集玉米胚乳蛋白，western blot检测AGPase酶大小亚基，初步证明大小亚基的磷酸化。从5天到40天不同授粉阶段的胚乳Phos-tag磷酸化检测结果表明，AGPase大小亚基磷酸化的变化规律呈先升高后降低的趋势。借助于Pro-Q diamond staining技术进一步证明了AGPase酶大小亚基的磷酸化在胚乳不同发育阶段均发生。用蛋白组学的方法鉴定了Phos-tag胚乳结合蛋白，在授粉后20天的玉米胚乳中，有10678个肽段被检测到，属于1733个蛋白，其中鉴定出21个AGPase亚小亚基Brittle-2（Bt2）的独特肽和27个大亚基Shrink-2（Sh2）的独特肽。利用itraq技术鉴定了AGPase酶大亚基Sh2在Ser187、Ser230、Sh2-Ser251、Sh2-Ser293、Sh2-Ser299、Thr222共计6个位点发生磷酸化，小亚基Bt2在Ser10、Bt2-Thr451、Bt2-Thr462，共计3个位点发生磷酸化。用去磷酸化试剂碱性磷酸酶处理玉米胚乳蛋白，检测AGPase催化形成的活性条带，发现碱性磷酸酶抑制AGPase酶活性。这些结果表明AGPase酶大小亚基的磷酸化是AGPase酶的一种新的活性调控方式。. 总之，项目的实施通过生物化学与分子生物学、酶学等方法，研究了AGPase的磷酸化及其对其活性可能的影响，取得的实验结果为进一步在玉米分子育种中通过关键限速酶AGPase酶大小亚基关键氨基酸位点的突变靶向改造玉米淀粉的合成提供了重要的理论依据，具有重要潜在应用价值。