橡胶树CRISPR/Cas9-sgRNA RNP基因组编辑体系构建及橡胶转移酶复合体解析研究

Natural rubber is an important strategic material and industrial raw materials, however, rubber clones specified for producing military and civil high performance natural rubber are margin in the world. Rubber hydrocarbon length is one of the key factors affecting the performance of natural rubber, and the latest in vitro experimental results show that the CPTL\CPT\REF complex controls the length of rubber hydrocarbon. However, the in vivo experimental evidence is lacking, and members of this complex are not clear. Based on the efficient somatic embryo regeneration system and particle gun technology, this project will first establish the rubber tree CRISPR/Cas9-sgRNA RNP genome editing system, and then delete functional domains of members of CPTL\CPT\REF gene family by double sgRNA, finally, confirm composition of members of rubber transferase complex by analysis of molecular weight of rubber hydrocarbon in edited plants. The successful implementation of the project will provide the target genes for the cultivation of high performance rubber, and promote the innovation of precise breeding technology.

天然橡胶是重要的战略物资和工业原料，然而，军民高性能胶品种培育处于世界空白。橡胶烃长度是影响天然胶性能的关键因素之一，最新体外实验结果显示，其受CPTL\CPT\REF等组成的橡胶转移酶复合体的调控，但是，尚未有体内实验证据解析此复合体的成员构成。本项目将在已有橡胶树高效体胚再生体系和基因枪技术的基础上，构建橡胶树CRISPR/Cas9-sgRNA RNP基因组编辑体系，并在此基础上，利用CRISPR/Cas9-sgRNA RNP精准编辑特性，筛选切割CPTL\CPT\REF基因家族成员功能域的特异双sgRNA，突变在胶乳中高表达的CPTL\CPT\REF家族成员，分析基因突变对编辑植株橡胶烃分子量的影响，解析橡胶转移酶复合体的成员构成。项目的成功实施，将为高性能橡胶基因工程品种培育提供靶基因，同时推动橡胶树精准育种技术创新。

天然橡胶是重要的战略物资和工业原料，然而，军民高性能胶品种培育处于世界空白。橡胶烃长度是影响天然橡胶性能的关键因素之一，分子量越高，品质越好。最新体外实验结果显示，其延伸长度受CPTL\CPT\REF等组成的橡胶转移酶复合体的调控，但是，尚未有体内实验证据解析此复合体的成员构成。本项目首先构建了橡胶树Crispr/Cas9基因组编辑体系，然后利用此体系对橡胶转移酶复合体家族成员进行编辑。首先，构建了高效的橡胶树原生质体瞬时转化体系，转化效率提高到50%以上，完全满足亚细胞定位与编辑效率检测等实验需要。然后，我们克隆了5个有功能的橡胶树内源的HbU6基因启动子，这些启动子为多靶点sgRNA载体构建提供了便利。随后，分别以质粒和RNP两种形式，实现了橡胶树原生质体CRISPR/Cas9瞬时转化基因编辑,编辑效率均超过了24%，此体系可以快速地对候选sgRNA靶点的编辑效率进行鉴定，为后续稳定转化编辑获得有效的编辑结果奠定基础。接着，用上述鉴定到HbU6-2启动子，构建了靶标橡胶树HbPDS基因的稳定转化基因编辑载体并完成对胚性愈伤的转化和抗性筛选，目前已经获得了发生白化表型的编辑胚块，并进入生根再生阶段，此结果证明了Crispr/Cas9系统在橡胶树功能基因研究中的有效性。最后，用鉴定到的高转录活性的HbU6-2启动子构建靶标CPTL/CPT/REF各家族基因，基于pCAMBIA1300的CRISPR/Cas9稳定转化编辑载体，并完成了对橡胶树胚性愈伤的转化，目前已筛选到CPTL、CPT发生编辑的愈伤，正在进行继代培养和植株再生工作，再生苗将为家族基因在橡胶树内功能首次提供体内证据，从而确定橡胶转移酶复合体的成员构成以及控制橡胶烃延伸的关键基因，并最终为高性能胶橡胶树新品种培育提供靶基因和进一步研究材料。