γ-synuclein介导细胞自噬对结肠癌细胞的保护作用及其机制

自噬作为溶酶体依赖的细胞自我降解过程，在多数情况下起到细胞保护作用使肿瘤细胞克服不良应激，一些癌基因的反应性激活可能参与自噬。我们在前期工作中初步证实γ-synuclein作为癌基因促进结肠癌细胞的恶性表型，且可能作为应激反应基因参与结肠癌细胞自噬，在此基础上，本研究拟深入探讨γ-synuclein介导细胞自噬对结肠癌细胞的保护作用及其机制。首先通过血清饥饿、内质网应激、化疗等不良应激，研究结肠癌细胞活性、凋亡与自噬的变化规律，建立可靠的自噬诱导模型，并分析相应γ-synuclein表达水平及启动子活性的变化；其次通过向结肠癌细胞转染γ-synuclein或RNA干扰抑制γ-synuclein的表达，研究不良应激诱导的自噬的变化，并探讨自噬的细胞保护作用；最后探讨γ-synuclein介导结肠癌细胞自噬的分子机制。通过以上研究，以期为结直肠癌治疗中针对细胞自噬进行靶向性干预提供理论依据。

本研究在血清饥饿、内质网应激、化疗等不良应激条件下，建立针对结肠癌细胞SW480和HCT116的自噬诱导模型，并确立了以血清饥饿（EBSS）和内质网应激（Thapsigargin, TG）为最佳自噬诱导方案。在此自噬诱导模型框架内，γ-synuclein表达水平的应激反应升高主要缘自转录因子AP-1和CREB与其启动子区相应顺式作用元件的结合，以及启动子区CpG岛的进一步去甲基化，增强了其转录活性。在已经确定的自噬诱导模型内，通过Western blot检测LC3B蛋白、丫啶橙（AO）染色、透射电镜、荧光显微镜观察GFP-LC3等方法，证实通过RNAi抑制γ-synuclein的表达后，HCT116细胞的自噬活性降低，凋亡水平升高，细胞活性降低，经典的自噬信号分子beclin1(ATG6)、p-ERK1/2等蛋白表达下降，p-AKT、p-mTOR蛋白表达升高。通过基因表达谱芯片检测γ-synuclein-RNAi HCT116细胞相对于野生型HCT116细胞的差异表达基因，共检测出上调基因125个，下调基因152个（包括LC3B基因）。通过生物信息学分析，包含4个上调基因和5个下调基因的信号通路进入了候选，通过Western blot验证，γ-synuclein可能通过调控ATG8(LC3B)、ATG6(beclin1)、ATG4B等自噬相关蛋白以及CDH1、FOS、RALB、BIRC3等基因而介导结肠癌细胞自噬。