酶裂解柱前衍生高效液相色谱检测糖化血红蛋白的方法研究

糖化血红蛋白是非妊娠糖尿病的首选诊断标准、是糖尿病血糖控制的金标准、是非糖尿病患者心血管风险的独立预警因子、被认为与胰岛素的作用等同。针对国际糖化血红蛋白测定的参考测量程序存在不足的现状，以及我们的前期实验结果提示:高效液相色谱要比液相色谱串联质谱分离肽的分离度高，本项目拟将血液中的糖化及非糖化血红蛋白消化酶解为糖基化及非糖基化六肽，通过在六肽的氨基酸上连接深色团等手段，使得测定吸收光谱由紫外光区移向可见光区，在此基础上，采用HPLC 测定衍生的糖基化及非糖基化六肽的峰面积比，无需校准，通过计算得出糖化血红蛋白的含量。本研究利用糖化血红蛋白定义为糖基化血红蛋白与总血红蛋白之比值的特点，从在氨基酸上联接深色团这个新视点探索糖化血红蛋白参考测量这一关键基准问题，为糖化血红蛋白参考测量提供新的思路，从而提高临床实验室测定结果的准确性、可比性程度，为糖尿病的诊断及并发症的防治提供有意义的依据。

摘要:. 糖尿病已成为全球范围流行病，糖化血红蛋白是世界卫生组织和国际专家委员会推荐的糖尿病诊断标准。然而用于疾病诊断的实验室测定结果却缺乏准确性和可比性，限制了这项新指标的临床应用。本项目首次利用糖化血红蛋白定义为糖基化血红蛋白与总血红蛋白之比值的特点，从在氨基酸上联接深色团这个新视点探索糖化血红蛋白测定这一关键问题，为糖化血红蛋白检测提供新的思路。项目围绕着糖基化衍生肽和液相色谱分离这些重要问题，从精准性、特异性和稳定性层面开展系统研究，取得了一些创新性成果。首先，我们采用蛋白内切酶将血红蛋白水解，得到糖基化与非糖基化六肽，然后，糖基化、非糖基化六肽与对氨基苯磺酸进行衍生反应，生成糖基化和非糖基化偶氮六肽衍生物，最后，采用液相色谱对衍生肽进行分离、测定，根据糖基化和非糖基化衍生六肽的峰面积比计算样本中糖化血红蛋白的量。本方法的总CV为0.90%～1.61%；对特异性研究结果显示：衍生血红蛋白、变异血红蛋白不干扰本方法；糖化血红蛋白在0.3% ～15.6%浓度范围内，线性关系良好，此范围远宽于临床样本浓度，可满足临床需求；对有证标准物质进行测定，测定值与认证值的偏差为-0.09%～0.19%，对应的偏倚为-3.81%～3.53%。采用本研究方法、参考测量程序和常规方法分别检测临床人血样本，测定结果分别与参考测量程序和常规方法结果做线性回归，相关系数分别为0.995 9和0.996 5，显示本方法与参考测量程序和常规方法都有良好的相关性。本研究建立了柱前衍生高效液相色谱糖化血红蛋白测定方法，且无需校准品。. 本方法具有良好的精准性、特异性和稳定性，有望在糖尿病的诊断、筛查和管理中发挥作用。