锌指核酶靶向治疗CIN及宫颈癌的实验研究

Infection of high-risk human papillomavirus (HPV), especially HPV16 and HPV18, is a vital pathological factor of the development of cervical cancer. Gene therapy of targeting HPV has a potential value of clinical application. However, there have not exist any approach with high efficiency and specificity. Our group had introduced zinc finger nucleases (ZFNs), which is a high efficient gene editing technology, into research of gene therapy. And our previous experiments has confirmed that ZFNs can induce cell apoptosis and inhibit proliferation of corresponding HPV positive cells, while cannot affect other HPV positive or HPV negative cells. This program is a continuation of the previous research. We plan to establish and optimize intravaginal transfection through transfecting EGFP or MRFP expression plasmids into mice vagina directly. Then determine the efficiency of topical transfection of ZFNs through transfection of ZFNs targeting EGFP into systemic expression EGFP transgenic mice. At last, using topical transfection of ZFNs targeting HPV16 E6E7 into K14-HPV16 transgenic mice (a CIN model) to explore the feasibility of ZFNs in prevention and treatment of CIN even cervical cancer.

高危型人乳头状瘤病毒（HPV）特别是16、18亚型HPV的感染是宫颈癌发生发展的重要病理因素，靶向HPV的基因治疗具有重大的理论意义和临床应用价值，然而目前尚没有高效且特异性的靶向HPV的基因治疗手段出现。本课题组前期通过引进高效的基因修饰技术锌指核酶（ZFNs），通过系统的的体外细胞实验，证实其能高效且特异性的诱导相应HPV亚型阳性细胞的凋亡和阻滞细胞的增殖，而对其他亚型阳性及HPV阴性细胞均无作用。本项目拟延续前期的研究成果，通过在小鼠阴道内直接转染EGFP或mRFP荧光蛋白质粒来建立和优化阴道内转染技术，通过在系统表达EGFP转基因小鼠阴道内转染靶向EGFP的ZFNs，明确ZFNs局部应用的效率，在K14-HPV16转基因小鼠（CIN模型）阴道内转染靶向HPV16 E6E7基因的ZFNs，在动物模型内探索利用ZFNs靶向防治CIN和宫颈癌的可行性。

高危型人乳头状瘤病毒（HPV）感染是宫颈上皮内病变及宫颈癌发生发展的重要生物学因素，高危型HPV（特别是HPV16和HPV18）癌基因E6E7的持续表达是HPV感染致病的关键步骤。因此，靶向切割HPV癌基因E6E7的基因治疗具有潜在的临床应用价值。项目组前期通过引进高效的基因修饰技术锌指核酶（ZFNs），通过系统的的体外细胞实验，证实其能高效且特异性的诱导相应HPV亚型阳性细胞的凋亡和阻滞细胞的增殖，而对其他亚型阳性及HPV阴性细胞均无作用。本项目创新建立小鼠阴道脱落细胞染色体系，通过观察脱落细胞确定小鼠动情周期的变化规律。通过在小鼠阴道内直接转染EGFP或mRFP荧光蛋白质粒来建立和优化阴道内转染技术，通过观察比较荧光表达情况，确定在动情后期转染的效率最高。根据体内转染试剂推荐用量范围，分别设置质粒/转染试剂比例梯度和质粒用量梯度，小鼠阴道脱落细胞荧光表达情况，确定10μg质粒转染效果最佳（此时整体转染总量约15μL，成年小鼠阴道内可容纳最多25μL），至此，建立小鼠阴道内转染体系。.引进并繁殖系统表达EGFP转基因小鼠模型，在EGFP转基因小鼠阴道内转染靶向EGFP的ZFN（命名为ZFN- EGFP）表达质粒，检测到EGFP转基因小鼠宫颈上皮内EGFP荧光明显减弱甚至部分淬灭。提示小鼠阴道内转染ZFN-EGFP可抑制EGFP荧光的表达，即小鼠阴道内转染ZFN可实现ZFN的表达并抑制目的基因的表达。小鼠宫颈局部转染ZFN-EGFP后，取宫颈局部组织，在各种不同转染条件下，大体观察未见明显宫颈及阴道上皮局部刺激反应，提示小鼠阴道内转染的安全性。.引进并繁殖K14-HPV16转基因小鼠（CIN模型），表型鉴定成功后，根据上述研究建立的阴道内ZFN转染体系，在其阴道内转染靶向HPV16 E6E7基因的ZFNs，免疫组化检测发现小鼠宫颈上皮HPV表达明显降低，HE染色证明宫颈上皮内瘤变明显逆转。.本项目通过动物实验证实体内应用ZFNs靶向防治CIN和宫颈癌的可行性，为HPV感染及宫颈上皮内瘤变的治疗提高新的途径。