HIF-1转染骨髓基质细胞移植治疗局灶性脑缺血再灌注损伤的应用基础研究

多年来，脑缺血缺氧性疾病一直是人类致死和致残因素中最的重要杀手，尤其是神经元损伤后功能修复始终为医学领域的重点难点之一。近年来，发现低氧诱导因子(HIF)是一种介导哺乳动物细胞低氧反应的核转录因子,广泛表达于各种组织细胞,并具有显著促进机体对低氧的适应性和耐受能力的作用。骨髓基质细胞（MSCs）又是最广泛的成体干细胞，该细胞移植可促进神经元的增殖、分化和迁移，有助于损伤神经元的恢复，细胞移植与基因治疗是目前最有潜力的载体。.本项目拟采用分子生物学技术将HIF-1转达给MSCs，将转染后的阳性细胞立体定位移植到脑缺血区，以梗死面积、形态学、神经行为学、细胞凋亡及相关生化指标，综合评价其对脑缺血再灌注损作的治疗作用。目的是率先尝试细胞移植与基因治疗相结合技术，发挥MSCs细胞移植和HIF-1调节缺氧应答的双重作用，为局灶性脑缺血再灌注损伤探索新的治疗途径，可望在该领域取得重要突破。

本课题总体目标是以HIF-1基因转染MSCs细胞移植治疗脑缺血再灌注损伤，可以发挥MSCs细胞移植和HIF-1调节缺氧应答的双重作用，探索治疗缺血再灌注损伤的新方法，并为认识缺血／缺氧性疾病的分子机制及治疗措施提供新的观点和手段。本项目分三年完成：第一年度完成“动物模型制作、HIF-1基因的克隆与真核表达载体的构建”；第二年度完成“大鼠MSCs培养、鉴定和传代接种，HIF-1基因转染MSCs、检测及定量与定性分析”；第三年度完成“HIF-lα转染骨髓间充质干细胞效率及分析，MSCs-HIF移植对MCAO大鼠保护作用及相关机制”。均按原计划完成了预期任务。在研究过程中，本项目率先采用分子生物学技术将HIF-1转达给MSCs，将转染后的阳性细胞立体定位移植到脑缺血区，以梗死面积、形态学、神经行为学、细胞凋亡及相关生化指标，综合评价其对脑缺血再灌注损作的治疗作用。通过系列研究取得如下结果:①成功进行了MSCs的分离、原代和传代培养，发现MSCs的分化与生长规律，以MSCs第4代细胞表面分子标物识别进行了鉴定，并成功进行研究了成脂和成骨诱导；②成功将Ad. HIF-lα转染给MSCs，通过重组pcDNA3.1与HIF-1α质粒测序，发现了Ad-HIF1α对hMSC的转染效率及生长规律，并对HIF-1α基因在BMSCs中的蛋白表达及定量分析；③应用局灶性脑缺血大鼠研究发现，HIF-1α 基因转染MSC对脑缺血具有一定保护作用，能明显改善其的行为学指标；④其作用机理与减少神经元凋亡和发挥Wnt/β-catenin信号通路的调节有关。结论:应用基因移植与细胞治疗相结合技术，能够发挥MSCs细胞移植和HIF-1调节缺氧应答的双重作用，明显减轻了局灶性脑缺血再灌注损伤，达到了预期目标。共获专利3项,发明专利1项,实用新型专利2项。撰写学术论文11篇，正式发表8篇，SCI收录4篇。培养研究生5名。获国家专利3项,其中发明专利1项,实用新型专利2项。