木尔坦棉花曲叶病毒C4蛋白抑制转录基因沉默的机理研究

Geminiviruses are single-stranded DNA (ssDNA) viruses that infect a wide range of plant species and are responsible for substantial crop damages worldwide. Geminivirus AC4/C4 gene overlaps entirely within the Rep coding region, but in a different open reading frame. In bipartite begomoviruses African cassava mosaic virus and Sri Lankan cassava mosaic virus, AC4 suppresses PTGS by binding to miRNAs and siRNAs. C4 affects movement of some curtoviruses and monopartite begomoviruses, and acts as a symptom determinant factor and cell cycle regulator. Transgenic expression of curtovirus C4 gene induces hyperplasia and alters plant development in Nicotiana benthamiana and Arabidopsis. These observations suggest the multifunctional nature of the C4 protein. To identify CLCuMuV C4-interacting proteins, we employed GFP Trap coupled with mass spectrometry analysis. GFP-tagged CLCuMuV C4 (GFP-C4) was expressed transiently in N. benthamiana leaves. When the LC-MS/MS polypeptide profiles were searched against N. benthamiana protein databases, S-adenosyl methionine synthesase (SAMS), a key enzyme in methyl cycle, was found with high scores. Our results further demonstrate that C4 interacts with NbSAMS2 in vitro and in vivo. This study will focus on how CLCuMuV C4 suppresses TGS-based anti-geminiviral defense in plant by interacting with SAMS, in order to clear the pathogenic mechanism of C4 in the establishment of CLCuMuV infection.

木尔坦棉花曲叶病毒（CLCuMuV）是严重威胁棉花生产的双生病毒，其编码的C4蛋白涉及到病毒的运动，转录水平基因沉默（TGS），转录后基因沉默（PTGS）的抑制以及干扰宿主植物细胞周期从而产生严重的类似病毒病害的症状，但其致病分子机制尚未清楚。为了揭示C4 蛋白在木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMuV)的入侵，运动及症状形成中的作用，我们将C4蛋白作为诱饵，质谱分析和免疫亲和纯化技术结合利用筛选到与DNA甲基化循环相关的关键蛋白SAMS。通过酵母双杂交和GST Pull-down实验验证了SAMS与C4蛋白的体外互作，并通过免疫共沉淀（Co-IP）和双分子荧光互补实验（BiFC）验证了其体内互作。因此，本研究将围绕CLCuMuV C4如何通过与SAMS的互作影响DNA甲基化途径来抑制宿主细胞对病毒基因的沉默展开研究，以期明确C4在CLCuMuV侵染中的致病机理。

宿主DNA甲基化是植物抗DNA病毒的天然防御反应。为了建立有效侵染，双生病毒（Geminivirus）通过编码特定蛋白来抑制植物对病毒DNA的沉默。本研究以木尔坦棉花曲叶病毒（CLCuMuV）为研究对象，分析双生病毒抵御植物转录水平基因沉默（Transcriptional gene silencing，TGS）的分子机制。.利用16-TGS转基因植物系统对CLCuMuV及其卫星DNA（CLCuMuB）的TGS抑制活性进行检测，结果显示，CLCuMuV和CLCuMuB均有TGS抑制活性。进一步研究表明，CLCuMuV致病复合体编码的C1、C2、C4及βC1 蛋白具有TGS抑制活性。通过亚硫酸氢盐测序技术证明，CLCuMuV致病复合体和上述病毒蛋白都以不同的程度抑制植物外源基因的启动子区域（35S启动子）及内源转座子（NbTnt1）的甲基化。.通过串联亲和纯化和质谱连用以及体内和体外实验鉴定CLCuMuV C4蛋白与植物甲基循环中的核心酶—S-腺苷甲硫氨酸合酶（SAMS）相互作用并抑制其酶活性。C4蛋白第13位精氨酸的突变（C4R13A）能够消失C4与SAMS相互作用并抑制SAMS酶活性的功能。进一步实验证明，C4蛋白的过量表达能够恢复转录水平沉默的GFP基因表达，并降低外源（35S启动子）和内源（NbTnt1）基因甲基化水平，而C4R13A则丧失了恢复TGS或降低甲基化水平的功能。C4R13A的病毒突变体（CLCuMuV-C4R13A）侵染植物后症状减轻、病毒DNA的积累减少，而其IR区的甲基化水平则明显增高。.NbSAMS基因的沉默能够抑制16-TGS植株中GFP基因的表达，同时也会增加植物对双生病毒的敏感性，并降低了CLCuMuV IR区的甲基化水平。.以上实验结果表明，CLCuMuV诱导植物甲基化介导的TGS途径并能成为它的靶标。CLCuMuV的C4蛋白通过与NbSAMS特异结合抑制SAMS活性，进而抑制NbSAMS介导的TGS，从而帮助病毒更有效的侵染宿主。.本研究揭示了C4抑制TGS的分子机制以及在病毒侵染过程中的重要作用。