结核杆菌膜囊泡RNA调控宿主细胞TLR8依赖的固有免疫应答研究

Innate immune response play an important role in macrophage against infectious Mycobacterium tuberculosis(M.tuberculosis). With the discovery of released nano-sized extracellular vesicles, recent studies have indicated that M.tuberculosis also released membrane vesicles(MVs) harboring immunologically active molecules. However, these molecules and their roles in immunity remain largely unclarified. In our previous study, we identified that there are plenty of RNAs in M.tuberculosis MVs for the first time (MVs-RNA), M.tuberculosis MVs treated macrophages have an increased expression of RNA-sensing Toll-like receptor 8(TLR8) and, partially independent of TLR2, an elevated releasing of cytokines TNF-α and IL-6. Through detecting TLR8 expression level, colocalization of MVs-RNA with TLR8, TLR8-mediated cytokines releasing and TLR8 signaling pathway activation, the current study will aim at RNAs in M.tuberculosis MVs to reveal their functions in cellular TLR8-mediated innate immune response; Using high-throughput sequencing technology, we can describe the RNA expression spectrum in M.tuberculosis MVs; After bioinformatic analysis and functional verification, we will further screen sequence-specific potential TLR8-sensed RNA ligands, helping to illuminate the mechanism of MVs-RNA in regulating host innate immunity and to develop MVs-RNA-based immunotherapy in the future.

巨噬细胞的固有免疫应答在抵御结核杆菌感染中发挥重要作用。细胞外膜囊泡作为结核杆菌的一种新的分泌系统，携带着多种生物大分子如病原相关分子模式，被宿主细胞摄入并引发胞内免疫反应，但膜囊泡的成分及其对免疫的调控机制尚未完全明确。本课题前期研究发现结核杆菌膜囊泡中存在丰富的RNA，膜囊泡可以诱导巨噬细胞内RNA识别受体TLR8表达上调并以部分不依赖TLR2的方式促进TNF-α、IL-6释放。本课题拟以结核杆菌膜囊泡RNA为研究对象，通过研究其对细胞内TLR8的表达、与TLR8共定位、对TLR8介导的细胞因子释放和信号通路激活的影响，揭示膜囊泡RNA对TLR8介导的固有免疫的作用；通过高通量测序描绘结核杆菌膜囊泡RNA表达谱、生物信息分析并进行功能验证筛选出膜囊泡中与TLR8作用的RNA配体，初步探讨膜囊泡RNA调节宿主细胞固有免疫的分子机制，为研发以结核杆菌膜囊泡RNA为药靶的免疫疗法提供新思路。

近年来，进化高度保守、普遍存在于多种生物体的细胞外膜泡这一分泌途径被发现。由哺乳动物来源的细胞外膜泡通常称为外泌体（exosome），革兰氏阳性菌和分枝杆菌来源的细胞外膜泡称为膜囊泡 (MVs)。目前，外泌体和膜囊泡在结核病发生发展中的作用和功能研究较少。原课题的研究对象主要为结核分枝杆菌（MTB）膜囊泡，研究目的是探索膜囊泡RNA对宿主细胞TLR8依赖的固有免疫应答的调控作用。根据实际情况，本项目追加研究对象——结核感染的宿主来源的外泌体，希望从更系统的角度全面阐明MTB与宿主细胞相互作用过程中的免疫学机制。主要研究进展包括：1）建立了MTB膜囊泡分离提取的技术流程，发现了MTB膜囊泡中含有丰富的RNA，测序并绘制了MTB膜囊泡RNA表达谱。功能实验表明，MTB膜囊泡可以诱发巨噬细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的释放。同时结核杆菌膜囊泡可以诱发细胞凋亡。部分研究成果已发表在《中国防痨杂志》上。2）建立了MTB感染巨噬细胞外泌体分离及表征方法，发现了MTB感染引起巨噬细胞及其外泌体转录组的显著改变，特别是MTB感染巨噬细胞的外泌体中含有MTB RNA，并且其数目和丰度要远高于细胞内MTB的转录本。用MTB感染细胞的外泌体处理人THP-1源巨噬细胞系后，与NC相比：可以显著上调TLR8的表达并促进TNF-α、IL-6以及IL-10的释放；同时，凋亡相关蛋白Caspase-3及其活化形式Caspase-3 Cleavage表达上调，相关研究结果已撰写SCI论文待投。3）开展了结核病人外泌体特异性small RNA分子标识及其功能分析，描绘了健康人、潜伏感染人群及活动性结核病患者血清外泌体small RNA图谱，分析了三组样本间的差异表达基因并进行了表达模式分类，q-PCR验证并筛选出潜伏感染人群及活动性结核病患者血清外泌体中潜在的结核病诊断分子标识，IPA功能和通路分析为深入研究结核病的发病机制提供了理论依据。相关研究结果发表在Frontiers in Microbiology上。综上，本课题研究结果不但提供了一些结核病检测和诊断的候选分子靶标，还从宿主和病原菌的角度阐述了膜囊泡在TLR8参与的固有免疫应答中的功能，为揭示结核病的免疫学机制奠定了基础。