姜花HcWRKY2转录因子调控花香主成分(E)-β-罗勒烯生物合成的分子机制

Hedychium coronarium is an important fragrant flower in tropical and subtropical regions. The most abundant constituent in its floral scent profile is (E)-β-ocimene. However, little is known about the transcriptional regulatory mechanism on the biosynthesis of (E)-β-ocimene. Previous researches revealed that HcTPS3 is the key structural gene in the biosynthesis of (E)-β-ocimene and the promoter of HcTPS3 contains three W-box cis-acting elements. We have identified a WRKY transcription factor HcWRKY2, whose spatio-temporal expression pattern is consistent with that of HcTPS3. In this study, we will analyze the subcellular localization，the interaction of homodimer/heterodimer, and the activity of binding and transcriptional activation with HcTPS3 promoter to understand the directly regulatory role and molecular mechanism of HcWRKY2 on HcTPS3 gene expression. Moreover, the function of HcWRKY2 will be identified using overexpression and RNA interference technology in H. coronarium. Furthermore, to construct the molecular regulatory network, the downstream genes of HcWRKY2 will be screened using RNA-Seq technology and their relationship with the formation of floral scent will be analyzed. The results obtained in this project will provide new insights into the molecular mechanism on the production of monoterpenoids in floral scent profiles and will provide the important gene resources and theoretical guidance for molecular breeding of scent-associated traits.

姜花是热带和亚热带地区重要的香型花卉，其主要花香成分为(E)-β-罗勒烯，然而(E)-β-罗勒烯生物合成的转录调控机制尚不明确。申请者前期研究明确了HcTPS3是调控姜花(E)-β-罗勒烯生物合成的关键结构基因，同时发现其启动子区域含有3个W-box顺式元件。前期工作已经筛选到一个与HcTPS3时空表达模式一致的转录因子HcWRKY2。本研究拟分析HcWRKY2的亚细胞定位、同/异源二聚体相互作用以及与启动子序列的结合和转录激活活性，以明确HcWRKY2对HcTPS3基因表达的直接调控作用及分子机制；拟通过姜花体内过表达和基因沉默技术明确HcWRKY2在(E)-β-罗勒烯生物合成过程中的作用，利用RNA-Seq发掘HcWRKY2的其它下游基因并分析其与花香形成的关系，构建分子调控网络。本项目的实施可为单萜类花香物质形成的分子机理研究提供新的线索，为花香性状育种提供基因资源和理论指导。

花香是观赏植物重要的观赏性状和商品性状，姜花是热带和亚热带地区重要的香型切花，其花香的主要成分为(E)-β-罗勒烯等单萜类物质，申请者前期明确了HcTPS3是调控姜花(E)-β-罗勒烯生物合成的关键结构基因，然而，(E)-β-罗勒烯生物合成的转录调控机制尚不明确。分析HcTPS3的启动子序列鉴定出多个W-box顺式元件，因此，本项目主要研究了姜花WRKY转录因子对(E)-β-罗勒烯生物合成的转录调控机制。本研究在白姜花基因组水平鉴定到163个WRKY转录因子，并对其进行了基因结构、系统进化和共线性分析。分析了白姜花WRKY的基因表达谱，筛选出9个高表达且与HcTPS3基因表达呈正相关的WRKY转录因子，并对其进行了克隆和荧光定量分析，其中，HcWRKY2与HcTPS3的时空表达模式相一致，将其确定为候选转录因子。亚细胞定位试验表明HcWRKY2为细胞核定位。采用反式激活试验和酵母单杂实验表明HcWRKY2可以结合并转录激活HcTPS3的启动子。进一步研究表明，HcWRKY2可以结合HcTPS3启动子的2个W-box基序。VIGS试验表明，沉默HcWRKY2后，(E)-β-罗勒烯和1,8-桉油醇的释放量均出现了显著下降；荧光定量PCR分析表明，沉默HcWRKY2后，HcWRKY2、HcTPS3和HcDXS1A的基因表达量均显著下降，说明HcTPS3和HcDXS1A可能为HcWRKY2的下游靶基因。酵母单杂交试验表明，HcWRKY2可以结合HcDXS1A启动子的W-box基序。以上结果表明，HcWRKY2通过调控HcTPS3和HcDXS1A的基因表达，调控(E)-β-罗勒烯的生物合成。本研究为单萜类花香物质形成的分子机理提供了新见解，为培育花香性状优良的姜花新品种提供了基因资源和理论基础。