基于调控NF-κB/MAPK信号转导的清热解毒扶正方药治疗克雷伯杆菌肺炎机制

Pneumonia is a common clinical disease with high incidence and mortality。Traditional Chinese Medicine in treating pneumonia have obvious advantages and features. On the basis of confirmed curative effect of Traditional Chinese Medicine of clearing heat-toxin and strengthening body resistance（Dusuqing）, the following study will be done. 1.The rat models with Klebsiella pneumoniae pneumonia will be made. The rats will be randomly divided into normal group, pneumonia group, Dusuqing groups (to be respectively treated high，middle or low dosages)and levofloxacin group.The expressions of the key genes(NF-κB,et al) and proteins(P-P38MAPK、P-JNK,et al) of NF-κB/MAPK signal Mechanism Research on Treatment of Klebsiella pneumoniae Pneumonia with Traditional Chinese Medicine of Clearing Heat-Toxin and Strengthening Body Resistance Basing on Regulating NF-κB/MAPK Signal transduction pathway will be detected by western-blot and real-time qPCR. The effect of Dusuqing on the above index will be observed. 2. The effect of the serum containing Dusuqing on the key genes and proteins of NF-κB/MAPK signal pathway in the pulmonary macrophages and epithelial cells after LPS stimulation will be observed. The significance of the study is clarifying the the mechanism of Dusuqing in treating pneumonia and offering an evidence on application of Traditional Chinese Medicine on pneumonia treatment and prevention.

肺炎是临床常见病，发病率、死亡率均较高。中医药治疗肺炎具有明显的优势和特点。本课题基于已确证的清热解毒扶正代表方药-毒素清临床疗效，拟研究内容为：一是制备克雷伯杆菌肺炎大鼠模型，将大鼠分为空白组、模型组和毒素清高、中、低剂量组及左氧氟沙星组，采用免疫印迹、实时荧光定量PCR等分子生物学技术，测定肺组织NF-κB/MAPK信号通路关键基因（NF-κB等）与蛋白（P-P38MAPK、P-JNK等）表达的变化，观察毒素清对NF-κB/MAPK信号通路指标的影响。二是采用细胞培养、血清药理学和分子生物学等技术，观察毒素清含药血清对LPS刺激下大鼠肺巨噬细胞和肺上皮细胞NF-κB/MAPK信号通路关键基因（NF-κB等）与蛋白（P-ERK、P-JNK等）表达的影响。通过研究，进一步阐明清热解毒扶正方药-毒素清治疗肺炎的作用机制，为中医药防治肺炎的应用及其深入研究提供依据。

背景 .肺炎是临床常见病，发病率和死亡率均较高。中医药治疗肺炎具有明显的优势和疗效。清热解毒扶正代表方药——毒素清具有清热解毒化痰、益气养阴之功效。本项目基于前期经大量研究而确证的毒素清临床疗效，从炎症重要信号通路NF-κB/MAPK通路层面入手，深入开展毒素清治疗细菌性肺炎作用机制的研究，为中药的临床应用提供依据。.研究内容 .第一部分：方法 制备克雷伯杆菌肺炎大鼠模型，将SD大鼠分为空白组、模型组、毒素清组和左氧氟沙星组。从肺组织病理学改变，白细胞数变化等方面观察毒素清的疗效；采用ELISA、免疫印迹、实时荧光定量等技术测定肺组织NF-κB/ MAPK信号通路关键基因与蛋白表达的变化，观察毒素清对肺组织中上述信号通路指标的影响。结果 1.与空白组比，模型组肺损伤评分明显升高，毒素清组肺损伤评分较模型组下降。2.细菌感染后大鼠肺组织细胞因子（IL-1、IL-6、MCP-1和MIP-2）、NF-κBmRNA的表达和P38MAPK、JNK46/54、ERK42/44蛋白的磷酸化水平均升高，毒素清组上述指标均较模型组下降。.第二部分：方法 制备毒素清低、中、高浓度含药血清，以LPS刺激的单核巨噬细胞和肺上皮细胞为研究对象，采用ELISA、免疫印迹、实时荧光定量等技术，观察不同浓度毒素清含药血清对上述两种细胞NF-κB/ MAPK信号通路的影响。结果 1. 以THP-1细胞为研究对象，在LPS刺激下，细胞因子（IL-1、IL-6、IL-8），TLR2、TLR4和NF-κBmRNA的表达以及P38MAPK、JNK46/54、ERK42/44蛋白的磷酸化水平均升高，毒素清含药血清组上述指标较LPS刺激组降低，以中高浓度组尤为显著。2. 以A549细胞为研究对象，在LPS刺激下，细胞因子（IL-1、IL-6、IL-8），TLR4和NF-κBmRNA的表达以及P38MAPK、JNK46/54、ERK42/44蛋白的磷酸化水平均升高，毒素清含药血清组上述指标较LPS刺激组下降（JNK指标除外），且各浓度组之间作用无差异。.结论和意义 .本研究发现，NF-κB/MAPK通路参与了细菌性肺炎的发生发展。毒素清治疗肺炎的机制是通过抑制NF-κB/MAPK通路的活化，降低炎症细胞因子的表达而实现的。本项目将为中医药临床应用和新药研发提供依据和思路。