AMPKα1调节介导Ca2+内流对高糖诱导内皮细胞调亡的影响及机制研究

Apoptosis of Endothelial cell is an initiating factor in the formation of Atherosclerosis(AS).The studies showed that high glucose-induced calcium influx in endothelial cells is an important mechanism of cells apoptosis by induction of apoptotic-related protein expression.Combined with our research and previous reports, AMP-activated protein kinase α1 (AMPKα1) suppressed calcium influx and apoptosis of endothelial cells, but the specific mechanisms merits further study. As a type of non-excitatory cells, calcium influx of endothelial cells mainly regulated by calcium stores operating-type calcium channels (SOC), there are also evidences showed that AMPKα1 regulated the expression of SOC protein.The project speculated the AMPKα1 inhibited expression of SOC protein, and then suppressed calcium influx and apoptosis of endothelial cells, which may contribute to prevention of Atherosclerosis. The group intends to establish a mouse model of diabetic atherosclerosis and regulating AMPKα1 protein expression by lentivirus vectors. This study is aim to observe the change of TRPC1 and Orai1 protein expression, measure the formation of atherosclerotic plaque and plaque endothelial cell apoptosis.Mouse endothelial cell line was also cultured in vitro. By using RNA interference, flow cytometry, laser scanning confocal microscopy and patch-clamp modern experimental methods, we will try to demonstrate the protective role of AMPKα1 in high glucose-mediated endothelial cell apoptosis in vitro, as well as in vivo model. We hope to find a new therpy target on diabetes accelerated-atherosclerosis.

内皮细胞凋亡是动脉粥样硬化（AS）形成的始动因素。研究表明高糖刺激内皮细胞钙内流升高、介导凋亡信号分子表达是细胞凋亡的重要机制。既往报道腺苷酸活化蛋白激酶α1（AMPKα1）抑制细胞钙内流和内皮细胞凋亡，其具体机制尚未明确。内皮细胞是非兴奋型细胞，主要由钙库操纵型钙通道(SOC)介导钙进入内皮细胞，有报道AMPKα1调节SOC蛋白表达，因此推测AMPKα1下调SOC蛋白表达抑制钙内流，使内皮细胞凋亡减少，从而防止AS发生。本项目拟建立糖尿病动脉粥样硬化小鼠模型，通过慢病毒载体调节AMPKα1蛋白表达，观察对内皮细胞TRPC1、Orai1蛋白表达的影响、动脉粥样硬化斑块形成、斑块内皮细胞凋亡情况；体外培养小鼠内皮细胞株，采用RNA干扰、流式细胞术、激光共聚焦显微镜以及膜片钳等现代实验方法，在体内、体外水平明确AMPKα1 拮抗高糖介导内皮细胞凋亡的作用，为防治DM-AS发生探索新的药物靶点。

研究表明高糖刺激内皮细胞钙内流升高、介导凋亡信号分子表达是细胞凋亡的重要机制。既往报道腺苷酸活化蛋白激酶α1（AMPKα1）抑制细胞钙内流和内皮细胞凋亡，其具体机制尚未明确。本项目通过分子生物学技术、免疫组化技术、分子克隆技术等试验方法，阐明了AMPKα1通过调控内皮细胞钙离子内流进而影响高糖刺激的AS加速形成的作用。主要研究结果如下：（1）初步完成了AMPK激动剂和抑制剂处理内皮细胞后对高糖诱导内皮凋亡的影响。同时观察了高糖诱导的钙内流对内皮凋亡的影响，此外白藜芦醇作为AMPK的激动剂，我们也观察了在不同时间的高糖刺激对内皮细胞凋亡的影响。动物实验方面已初步完成了糖尿病动脉粥样硬化小鼠模型，并通过尾静脉注射AMPKα1过表达和干扰病毒对粥样斑块形成的影响。（2）完成了AMPKα1对小鼠粥样斑块的影响及其机制探讨。前期完成了AMPKα1过表达和干扰慢病毒构建，通过尾静脉注射方法将AMPKα1过表达注射入小鼠体内，并观察AMPKα1过表达对小鼠粥样斑块的影响。另一方面，从两个方面初步阐述了AMPKα1过表达对小鼠粥样斑块形成影响的机制：第一，AMPKα1过表达可能通过调节内皮细胞内Ca2+内流进而影响内皮细胞的凋亡影响粥样斑块的形成；第二，AMPKα1过表达可抑制内皮细胞内质网应激，进而抑制粥样斑块的形成。（3）通过观察高糖对内皮细胞功能影响，初步阐明了成纤维细胞生长因子-21通过激活AMPK信号通路进而阻断高糖损伤内皮细胞功能的作用及机制。（4）在心衰的研究中发现，Klotho蛋白阻断氧化应激进而保护心肌细胞的作用。（5）观察了白藜芦醇激活AMPK进而阻断高糖诱导的内皮细胞氧化应激和内皮细胞损伤作用和机制；（6）通过对冠心病患者的临床观察，发现冠心病患者 T 细胞 Stim1 表达水平增高，Stim1 可通过调节 Ca2 + 内流进而影响 T 淋巴细胞亚群活性，促进动脉粥样硬化的进展。同时探讨老年女性患者血 浆中骨代谢检测指标与冠心病发病关系，结果提示维生素D水平降低与冠心病呈正相关，可作为预测指标。