内分泌干扰物对硬骨鱼生殖激素合成关键基因表达启动的影响

Endocrine disrupting chemicals (EDCs) are proved to influence reproductive hormone synthesis and related gene expressions. But it is unclear that these were caused through estrogen/androgen receptor feedback pathway or non-receptor pathway, for lacking of direct evidence. We verified that nonylphenol (NP), a typical estrogenic effect EDC, could increase the activity of cyp19a promoter by using luciferase reporter gene expression vector. But the influences of EDCs on gene expressions of sexual hormone synthesis might be quite different in different genes and upon different EDCs. The present project aims to clarify which kinds of EDCs could directly trigger the gene expressions through luciferase reporter gene expression vector, to study the effects of EDCs on interaction of transcription factors and gene with ChIP, and to explore EDCs on promoter methylation. The conduction of the present study not only provides direct evidences of influence of EDCs on gene expressions of reproductive hormone synthesis, but also is valuable to reveal the endocrine disrupting mechanisms of EDCs on teleosts.

内分泌干扰物（EDCs）可对硬骨鱼生殖激素合成途径中关键酶基因表达产生影响。但这种影响主要是由于通过EDCs与受体结合介导的、还是非受体途径导致的尚不清楚。我们已开展的研究发现EDCs可直接影响生殖激素合成酶基因cyp19a启动子的活性。但EDCs对于合成酶基因表达的干扰作用可能依不同EDCs及不同基因而存在差异。本项目拟进一步采用荧光素酶报告基因技术及DNA Pull down、ChIP等方法，选择几类代表性EDCs处理，通过分析更多关键基因的启动子活性、启动子DNA序列与转录因子的结合、启动子甲基化等变化，旨在回答哪些EDCs可直接影响基因表达的启动及干扰基因表达，并揭示其干扰机理。本项目的开展对进一步阐明EDCs的内分泌干扰机制提供新的实验证据和思路，为生态毒理评价提供依据。

硬骨鱼的内分泌干扰作用机制影响主要是由于通过EDCs与受体结合介导的、还是非受体途径导致的尚存不明之处。本项目主要研究了内分泌干扰物（EDCs）对斑马鱼（Danio rerio）生殖激素合成途径中关键酶基因表达的影响机制。选择了酚类内分泌干扰物、全氟化合物及其新型替代物，针对生殖激素合成途径中的关键基因: cyp19a1a和cyp17a，建立了含这两个基因启动子序列的双荧光素酶表达载体，检测发现几种EDCs可增强cyp19a1a启动子活性，证明这些类雌激素物质可通过非受体途径直接导致生殖激素合成基因表达的调高而产生内分泌干扰效应。转录因子SF-1对于cyp19a1a的基因表达的具有重要作用，低浓度的酚类EDCs可导致sf-1基因的表达调高，尤其是在斑马鱼发育的关键时期影响较大。全氟类化合物暴露后斑马鱼性腺类固醇生成相关基因cyp17a1、cyp19ala、stat3、sf-1基因mRNA转录水平变化表现出明显的两性差异，对雄性斑马鱼性腺类固醇生成相关基因转录活性的影响要大于雌性。表明PFOA的新型含氟替代物也具有内分泌干扰效应。NP和三种双酚类物质暴露后斑马鱼cyp19a1a基因启动子区域的CpG位点会发生部分去甲基化的情况，从而使整体甲基化水平降低，作用强度依次为：NP>BPA>BPS>BPF。DNA去甲基化作用主要发生在雄鱼体内。这一结果证明了EDCs可通过影响表观遗传、进而引起内分泌干扰效应。.另外，我们还开展了纳米氧化物颗粒对浮游甲壳类蚤状溞（Daphnia pulex）的毒性效应及机制。应用蛋白质组学技术比较了纳米氧化锌、普通氧化锌及硫酸锌对蚤状溞的毒性机理，发现纳米氧化锌的毒性主要由其溶解出的锌离子引起，可破坏了蚤状溞的内环境稳态，引起其几丁质酶表达下调、破坏细胞钙离子平衡等。用不同解离程度的纳米氧化物颗粒研究对溞蜕皮及能量代谢的影响，发现难解离的纳米氧化钛及纳米氧化硅对溞蜕皮及能量代谢的影响趋势与易解离的纳米氧化锌相反，难解离的纳米团聚体附着于溞体体表，诱导蜕皮提前发生，加速能量代谢可能是这一类纳米颗粒对溞产生毒性的潜在机制之一。