Rheb与生长板软骨发育的表观遗传调控研究

Although it is well established that endochondral bone formation depends on a highly coordinated programme of chondrocyte proliferation, differentiation and maturation within the mammalian growth plate, the epigenetic mechanisms that coordinate chondrocytes growth, proliferation and differentiation during this process are not well understood. In our preliminary work, , we obtained the proliferative chondrocytes and hypertrophic chondrocytes from mouse growth plate using laser capture microdissection (LCM), and successfully performed genome DNA methylation sequencing (WGBS). In addition, we generated mice with Rheb knockout in chondrocyte (Col2-Rheb) or in limb bud stem cells (Prx1-Rheb) by crossing a Col2a1-cre mice line with a Rheb-loxp mice line, or a Prx1-cre mice line with a Rheb-loxp mice line respectively. Loss of Rheb either in chondrocytes or in the limb bud stem cells caused chondrodysplasia and dwarfism in mice, indicating that Rheb plays an essential role in endochondral bone development. By using LCM, WGBS and RNA sequencing, the current project aims to screen and identify the key molecules that coordinate chondrocyte development. In addition, how DNA methylation are modulated and its role in chondrocyte proliferation, differentiation and maturation will be explored. Furthermore, mice with Rheb knockout in chondrocyte (Col2-Rheb), limb bud stem cells (Prx1-Rheb) and hypertrophic chondrocyte (Col10-Rheb) will be generated to identify the role and epigenetic regulation of Rheb in chondrocyte development. This project will provide novel mechanisms for coordination of cell proliferation and differentiation, and evidence for prevention and treatment of aberrant chondrocyte proliferation and differentiation-related diseases.

软骨发育过程中生长板软骨干细胞依次经历生长、增殖、分化和凋亡，但精准协调这一过程的表观遗传调控机制不清楚。课题组前期使用激光捕获显微切割技术(LCM)获取小鼠生长板增殖与肥大期软骨细胞，进行全基因组DNA甲基化测序(WGBS)获得成功。此外，构建的软骨细胞(Col2a1-Cre)与肢芽干细胞(Prx1-Cre)敲除小G蛋白Rheb的小鼠出现软骨内成骨障碍与侏儒症，提示Rheb在软骨发育中起重要作用。本项目拟使用LCM技术获得生长板静息期、增殖期及肥大期软骨细胞，应用WGBS与转录组分析各期软骨细胞DNA甲基化差异，筛选协调软骨细胞发育的关键节点分子与表观遗传机制。同时构建肢芽干细胞、软骨细胞和肥大软骨细胞(Col10a1-Cre)敲除Rheb的小鼠，明确Rheb在软骨发育中的作用及其表观遗传调节机制，为细胞生长增殖与分化的协调机制提供新观点，为软骨细胞增殖分化异常相关疾病的防治提供新思路

发育过程中细胞生长、增殖、分化和凋亡的精准协调与偶联机制是发育生物学领域的关键科学问题。小G蛋白Rheb已被确立为响应生长因子和营养物质的细胞增殖和分化的关键调节因子。然而，Rheb在肢体发育中的作用仍然未知。本研究对3例15-18周龄人类胎儿生长板软骨细胞进行单细胞转录组测序，从单细胞水平分析了调控人类胚胎生长板软骨细胞分化与成熟的调控基因，并进一步通过实验明确 Rheb 在生长板软骨细胞生长、增殖与成熟分化相互偶联与软骨发育过程中的作用。我们发现：（1）生长板软骨细胞可根据其功能及细胞周期特征，分为静息期软骨细胞，增殖期软骨细胞，前肥大期软骨细胞，肥大期软骨细胞，终末期软骨细胞以及首次报道的调控性软骨细胞；（2）通过对人类胚胎生长板软骨细胞的进一步分析，我们发现存在于人类胚胎生长板软骨细胞中调控性软骨细胞亚群。这一类细胞亚群主要通过 NOTCH 信号通路中的 JAG1、DLL1 调节增殖期及肥大期软骨细胞；（3）Rheb在生长板静息期软骨细胞内表达相对较弱，肥大期软骨细胞内表达强度稍强于静息期软骨细胞，但是在增殖期软骨细胞内显著高表达；（4）鉴于Prrx1+肢芽样间充质干细胞是肢体软骨细胞的来源，并且对软骨内骨化至关重要，我们使用Prrx1-Cre条件性地敲除了Rheb，并在Prrx1-Cre;Rheb1fl/fl小鼠中发现了肢体侏儒症。（5）Rheb条件敲除（cKO）小鼠的生长板中增殖区的高度比例显著减少，肥厚区的高度比例增加，导致生长板变短，表明软骨内骨化异常。（6）有趣的是，虽然Rheb缺失深刻地抑制了肢体软骨中的转录因子Sox9，但Runx2和2型胶原蛋白的水平都有所增加。这些新发现强调了Rheb在肢体生长中的重要作用，并表明Rheb在软骨细胞增殖和分化中的复杂调节。尽管在目前的研究中尚未彻底确定改变软骨命运的确切分子机制，但是我们的研究为Rheb调节肢体生长提供了第一个体内证据。