应用加载双向诱导分化的hUCMSCs的壳聚糖温敏凝胶促进移植牙根-骨牙周膜愈合的实验研究

自体牙移植是传统义齿和种植义齿之外的缺牙修复方法。因为移植术中供牙牙周膜损伤概率大，影响移植成功率，临床应用受到极大限制。目前骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）和牙周膜来源的牙周膜干细胞（PDLSCs）的应用成为促进牙周组织再生的研究热点，但是同种异体细胞移植的免疫原性反应，以及自体细胞移植的取材有创和来源受限，研究应用前景受到限制。因此我们提出使用低免疫源性，无创及丰富来源的人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）作为牙周组织再生的新型种子细胞，拟分别诱导其向成骨细胞和牙周膜细胞方向分化；同时制备壳聚糖温敏凝胶作为细胞的可注射型载体，观察两种定向分化细胞在离体牙根表面的粘附和分化以及共培养后的转归；最后通过动物体内实验验证将加载不同细胞的凝胶同期或分期植入移植牙根-骨结合区界面后牙周膜样组织和骨样组织再生和共生的可能性。

首先，通过原代培养的方法获得hUCMSCs，经成骨诱导后进行检测鉴定。结果发现， hUCMSCs表达间充质干细胞标记物；成骨诱导21天后茜素红染色阳性，免疫荧光染色检测胞浆内大量表达骨桥蛋白OPN；碱性磷酸酶ALP活性和OPN（mRNA水平）在第7天时即表现出具有统计学差异的升高，Runx2则在第7天时达到峰值。提示：hUCMSCs经体外诱导7d后，成骨分化进行已经全面启动。随后，我们在体外将hUCMSCs成骨诱导后以纤维蛋白胶为载体，复合离体牙根来源的牙本质切片，植入裸鼠体内后，经组织学检测，2个月时牙本质表面有新骨形成，类似于“牙骨质/牙周膜”样结构。.其次，制备壳聚糖温敏凝胶，用凝胶浸提液培养hUCMSCs，检测细胞增殖情况，并进行成骨诱导。结果发现， hUCMSCs在壳聚糖温敏凝胶浸提液中的增殖情况与常规培养液中无显著性差异。凝胶中生长的hUCMSCs成骨诱导21d时可见到钙结节。随后，我们将经过成骨诱导的hUCMSCs复合凝胶植入小鼠体内，2个月后能够形成结节样组织，但是组织学染色发现其内有大量炎细胞浸润。这说明，虽然hUCMSCs在小鼠体内移植时产生了比较重的炎症反应，并没有起到促进成骨的作用。.然后，我们应用Transwell小室将原代培养获得的hUCMSCs和人牙周膜细胞（hPDLs）进行非接触式共培养；检测hUCMSCs干细胞标记物CD146、SOX2、SSEA和Stro-1，以及波形蛋白（Vimentin）在hUCMSCs中的变化情况。结果：共培养过程中hUCMSCs中的CD146、SOX2、SSEA和Stro-1持续降低；而Vimentin持续增高。波形蛋白Western blot检测也有明显统计学差异。说明与hPDLs共培养后，hUCMSCs具有向牙周膜细胞方向分化的趋势。.目前，我们的课题全面进入动物实验阶段，以壳聚糖温敏凝胶为载体复合两种诱导分化方向的细胞，再复合牙本质切片的细胞复合材料已经植入裸鼠体内。该细胞凝胶复合物经摸索优化后也做了大型动物犬的预实验，我们将犬的牙齿拔出后在拔牙窝和牙根表面植入细胞凝胶复合物，然后再原位植入牙槽窝。上述动物实验正在进行中，结果待观察回报。.目前，一共发表5篇中文，1篇英文SCI。主译出版译著1部，参编1部，以第一申请人获批实用新型专利1项。培养博士研究生1名。举办中华口腔医学会学习班2次。