SARS冠状病毒主蛋白酶C端结构域三维结构域交换双体的形成机制及单双体转化机制研究

在关于SARS冠状病毒主蛋白酶的研究中，我们发现其C端结构域（Mpro-C）能够形成三维结构域交换双体，这种双体也是我们新发现的SARS冠状病毒主蛋白酶一种活性成分八聚体具有高酶活的结构基础。Mpro-C单体和结构域交换双体在25℃几天内观察不到相互转化，在35℃近生理条件的溶液中能相互转化，并且这一交换反应需要位于蛋白质核心的α1螺旋打开继而相互交换。本项目旨在将核磁共振波谱学、分子生物学、生物化学和物理化学的研究手段相结合，研究Mpro-C特殊的结构域交换双体的形成机制以及单双体交换机制。本研究将深化对三维结构域交换的发生机制的理解，也将有助于我们理解非变性条件下研究蛋白质折叠状态及其动态变化、不同结构状态转换的机制，同时还将加深我们对新发现的高酶活八聚体的结构与功能关系的认识，有助于针对主蛋白酶抑制剂的抗SRAS药物的研发。

在关于SARS冠状病毒主蛋白酶的研究中，我们发现其C端结构域（Mpro-C）能够通过交换位于蛋白质疏水核心的α1螺旋形成三维结构域交换双体，这种双体也是我们新发现的SARS冠状病毒主蛋白酶一种活性成分八聚体具有高酶活的结构基础。Mpro -C的单体和结构域交换双体在25 ˚C时很稳定，数天内观察不到变化，温度升高到37 ˚C时，能够观察到两者发生相互转化。本项目着重研究Mpro-C由单体转化形成结构域交换双体的机制，我们研究了Mpro-C单体和结构域交换双体在不同溶液条件下转化反应的化学动力学和热力学性质，计算得到了单体聚合和结构域交换双体解离过程的活化能远高于蛋白质普通聚合过程的活化能远高于蛋白质普通聚合过程的活化能，接近甚至超过蛋白质变性过程的活化能，表明Mpro-C的单体和结构域交换双体转化需要通过特别的机制发生。此外我们利用核磁共振氢氘交换技术研究了Mpro-C单体的结构稳定性，结合Mpro-C的热稳定性，说明Mpro-C由单体形成结构域交换双体并非完全去折叠态或者通过α1螺旋能瞬间暴露于溶液中的类熔球态发生。我们还解析了Mpro-C单体在25 ˚C，2.5 M尿素溶液中的溶液结构，并分析了Mpro-C在能发生结构域交换的溶液条件中的共同结构特征： 11-106号氨基酸残基保持了Mpro-C单体不能发生结构域交换溶液条件中的结构特征，107-114号氨基酸残基呈无规则卷曲结构，不再形成α螺旋结构，并且活动性增加，同时α5螺旋和α1螺旋间的相互作用大量减少。Mpro-C的一系列C末端切除突变体和点突变的研究结果进一步证实C末端在Mpro-C结构域交换过程中除起到阻挡α1螺旋发生结构域交换的作用外，还直接参与介导Mpro-C结构域交换过程的发生。此外，在能发生结构域交换的溶液条件中，发现两个Mpro-C分子可以通过呈现无规则卷曲构象的C末端彼此间发生相互作用，从而自聚合。综合以上研究结果，提出Mpro-C单体转化形成结构域交换双体的模型：首先，C末端发生构象变化，由α螺旋形成无规则卷曲结构，呈现无规则卷曲结构的C末端通过介导两分子Mpro-C自聚合从而介导结构域交换的发生。这是第一次报道蛋白质发生结构域交换的过程能够被非交换的其他结构单元所介导和调控，这深化了对结构域交换发生机理的认识和理解。