SARS冠状病毒主蛋白酶C端结构域三维结构域交换双体和高聚体的形成机制及转化机制研究

We have previously discovered that C-terminal domain of SARS-CoV main protease (Mpro-C) can form a stable domain-swapped dimer with its α1-helice exchanging their positions. Furthermore, the full length Mpro can self assembles into a super-active octamer composed of four domain-swapped dimer subunits due to the swapping of C-terminal domains, which enable the enzyme to be locked in the active conformation and to be constantly active. At 25C, no interconversion between monomeric and domain-swapped dimeric forms can be observed in a few days. As 37C, the two forms of Mpro-C can reversibly interconvert with each other under physiological condition. It should be noted that the swapping element α1-helix is completed buried in protein hydrophobic core, which means the swapping process need the release of the α1-helix firstly. In this study, we are going to explore the mechanism of Mpro-C domain swapping process by a combination of techniques of NMR, molecular biology, biochemistry, physical chemistry. Our study will deepen the knowledge about 3D domain swapping and protein folding, and also the understanding in the structure and function of super-active octamer, then facilitating the anti-SARS-CoV agent development.

在关于SARS冠状病毒主蛋白酶的研究中，我们发现其C端结构域（Mpro-C）能够形成三维结构域交换双体，这种双体也是我们新发现的SARS冠状病毒主蛋白酶一种活性成分八聚体具有高酶活的结构基础。Mpro-C单体和结构域交换双体在25℃几天内观察不到相互转化，在35℃近生理条件的溶液中能相互转化，并能够形成类淀粉样纤维的高聚体，并且这一交换反应需要位于蛋白质核心的α1螺旋打开继而相互交换。本项目旨在将核磁共振波谱学、分子生物学、生物化学和物理化学的研究手段相结合，研究Mpro-C特殊的结构域交换双体和高聚体的形成机制以及交换机制。本研究将深化对三维结构域交换的发生机制的理解，也将有助于我们理解非变性条件下研究蛋白质折叠状态及其动态变化、不同结构状态转换的机制，同时还将加深我们对新发现的高酶活八聚体的结构与功能关系的认识，有助于针对主蛋白酶抑制剂的抗SRAS药物的研发。

Mpro-C为SARS冠状病毒主蛋白酶的C端结构域，其单体分子间可通过互换位于疏水核心中的α1螺旋形成三维结构域交换的双体，并且结构域交换双体具备与单体类似的α螺旋结构。在体外近生理条件下（37°C、pH 7.0），Mpro-C的单双体间可相互转化，并可形成分子量随时间逐渐增大的多聚体，直至析出为蛋白质沉淀。经实验鉴定，沉淀为具有cross-β结构的成熟淀粉样纤维，而可溶性多聚体为其前体原纤维。.淀粉样纤维是阿兹海默症、海绵状脑病等疾病的重要病理特征，也与细菌菌毛形成、激素存储等生理功能密切相关，其形成的分子机制被广泛关注。已有的研究发现，多个能形成淀粉样纤维的蛋白质可通过分子间互换结构单元而形成三维结构域交换的双体和/或寡聚体，而且三维结构域交换的发生与淀粉样纤维的形成存在相关性，因而一种连续结构域交换模型被提出可能是淀粉样纤维形成的一种机制。然而，该模型却与许多实验证据之间存在矛盾，有待进一步深入研究。.本研究以Mpro-C为模式蛋白，利用核磁共振实验，结合分子动力学模拟，研究了在体外近生理条件下Mpro-C发生三维结构域交换及形成淀粉样纤维的机制，并从结构动态变化的角度阐明了二者之间的相互关系。.研究发现，三维结构域交换与淀粉样纤维形成两个过程可能共享了早期的折叠路径，故在实验上能观测到二者之间有相关性。但是，两个过程所需暴露的关键区域或位点及后期的折叠路径不同，使得二者之间并无因果性，淀粉样纤维的构象与单体或结构域交换双体的构象也存在明显的差异，三维结构域交换也并非形成淀粉样纤维所必须的。.据此，我们认为，三维结构域交换反映了蛋白质具备发生较大构象变化的能力，此类构象变化的能力在促进三维结构域交换发生的同时，还可能会有一定的概率造成错误折叠并导致淀粉样纤维的形成，故这两个过程之间会有一定的相关性，而连续结构域交换并不是淀粉样纤维形成的机制。本研究为理解三维结构域交换蛋白形成淀粉样纤维的分子机制提供了有益的参考和新的见解。