从Wnt/β-catenin信号通路研究补肾活血中药干预对子宫内膜干细胞增殖的影响

The reinforcing kidney and activating blood compound is our treatment of endometriosis experience prescription,clinical curative effect,the recurrence rate is low,but the exact mechanism has not been clarified.The preliminary study confirmed that it can promote ectopic endometrial cells apoptosis occurred, ectopic focal atrophy and retreat. Recent research shows that endometrial stem cells abnormal proliferation and differentiation in relation to Wnt/β-catenin signal path.Accordingly,we propose the reinforcing kidney and activating blood compound is through intervention Wnt/β-catenin signal path or not, to inhibit endometrial stem cells proliferation and apoptosis, and to promote the prevention and control of recurrence hypothesis.In order to validate the deduce,this study intends to extract in and ectopic endometrial tissue from patients with endometriosis,normal, culture in vitro,and use immunofluorescence,RT-PCR and Western-blot technical to detect stem cells related to spectrum markers of expression, by adding different concentrations of the reinforcing kidney and activating blood compound with chinese medicine serum, observation of traditional chinese medicine on endometrial stem cells proliferation, apoptosis influence and Wnt/β-catenin path factor expression of change, at the same time experiment with rats in endometriosis model,from the cells, molecules, protein, apoptosis levels,clarify the effective mechanism with the reinforcing kidney and activating blood compound on the prevention and control of endometriosis recurrence,for the clinical application of the prescription establishing a solid theoretical basis.

补肾活血复方是我院治疗内异症的经验方，临床疗效确切，复发率低，但机制尚未阐明。前期研究初步证实该方可促进异位内膜细胞发生凋亡，使异位病灶萎缩、消退。新近研究表明子宫内膜干细胞的异常增殖、分化与Wnt/β-catenin信号通路有关。据此，我们提出补肾活血复方是否通过干预Wnt/β-catenin信号通路，抑制子宫内膜干细胞增殖、促进其凋亡，从而防治复发的假说。为了验证这一推断，本研究拟提取内异症患者在位、异位及正常人子宫内膜组织，进行体外培养，并运用免疫荧光、RT-PCR及Western-blot技术检测干细胞相关标记物的表达，通过加入不同浓度的补肾活血复方含药血清，观察中药对子宫内膜干细胞增殖、凋亡的影响及Wnt/β-catenin通路因子表达的变化，同时进行内异症大鼠模型在体实验，从细胞、分子、蛋白、凋亡水平，阐述补肾活血复方防治内异症复发的有效机制，为该方的临床应用奠定坚实的理论基础

子宫内膜异位症病变广泛、形态多样，极具侵袭和复发性，成为“难治之症”；尤其是EMs发病机制不清、药物和手术治疗不满意，成为妇科研究之焦点，而针对EMs病机的分析是提供更为有效治疗手段的关键。研究表明子宫内膜干细胞的异常增殖、凋亡下降与Wnt信号通路有关。近年来中医药治疗EMs在临床实践中已凸显出优越性。根据肾虚血瘀的病机凝练出的补肾活血复方是导师治疗EMs的经验方，临床疗效确切，复发率低，但机制尚未阐明。课题组结合现代医学有关EMs与干细胞、Wnt信号通路发病机制的最新研究，提出补肾活血复方是否通过干预Wnt信号通路，抑制子宫内膜干细胞增殖、促进其凋亡，从而防治复发的假说。为了验证这一假说，本研究提取了EMs患者在位、异位及正常人子宫内膜组织，进行体外培养，并运用相关技术检测干细胞相关标记物的表达，通过加入不同浓度的补肾活血复方含药血清，观察中药对子宫内膜干细胞增殖、凋亡的影响及Wnt通路因子表达的变化，同时进行EMs大鼠模型在体实验，从细胞、分子、蛋白、凋亡水平，阐述补肾活血复方防治EMs复发的有效机制。通过本研究得出结论：1）EMs患者在位、异位及正常人子宫内膜中存在干细胞，CD34、CD117蛋白及Oct-4基因在子宫内膜干细胞中呈阳性表达，对其分离、培养，可作为研究EMs发病机制的体外模型。2）补肾活血含药血清的体外干预实验发现，补肾活血高剂量组以及西药组均可诱导子宫在位、异位内膜干细胞凋亡，有统计学意义（P＜0.05），并且具有降低子宫内膜干细胞 Wnt7a、β-catenin、VEGF、MMP-9通路因子表达的趋势，由此证实了子宫内膜干细胞凋亡功能下降以及wnt信号通路激活是EMs的发病机制，补肾活血中药可促进子宫内膜干细胞发生凋亡，从而起到治疗的作用。3）补肾活血复方干预EMs模型大鼠的体内实验发现，模型组异位内膜组织生长良好，中药高剂量与西药组异位内膜组织萎缩；与模型组比较，中药高剂量组和西药组在位、异位内膜细胞中Wnt7a、β-catenin蛋白的表达水平下降，且均优于中药低剂量组（P＜0.05）。进一步证实了补肾活血中药可促进子宫内膜细胞凋亡，并可抑制Wnt通路的关键调节因子的表达。本研究对于寻找EMs合理的靶点治疗提供有力的实验依据，同时也为中医药防治EMs开拓新的思路，具有重要的科学意义。