不同发展速度肺脾虚损慢性阻塞性肺疾病患者血液差异蛋白筛选及相关因子验证研究

We discoverd the development process of the part of COPD patients present development speed especially "fast" and "slow" two extreme phenomenon in our clinical wrok, appear this kind of phenomenon has its internal causes. In the lately study,our group discussed the two types of development of "fast" and "slow"patients from constitution in traditional Chinese medicine, Viscera deficiency, imbalance of Th17 / Treg and ADAM33, NO synthetase SNPs ,etc. It found that fei-pi deficiency in two groups of patients have a high proportion, the group of "fast" development of Th17 / Treg and related factors in patients with increased expression. Based on the above, this study will take the protein expression differences as the breakthrough point, focus on two types of fei-pi deficiency patients with copd in peripheral blood in differences protein screening, to explore the disease developing speed difference of signaling pathways, focus on the inflammation related signaling pathway and through the flow liquid multiple protein technology, fluorescence quantitative PCR, Western blot detecting inflammation related signaling pathways upstream and downstream cytokines expression. Trying to find out two kinds of patients differences protein or related markers, with the markers predict illness development direction and speed, monitoring the disease, in order to achieve the prevention and intervention in patients with chronic obstructive pulmonary disease "fast" to "intermediate state" or "slow", and provide ideas for future research.

临床发现，慢阻肺在发展过程中部分患者病情呈现出发展速度特别“快”和特别“慢”两种极端的现象，出现这种现象一定有其内在原因。前期课题组对发展“快”“慢”两类患者从中医体质、脏腑虚损、Th17/Treg失衡、ADAM33、NO合成酶SNPs等进方面进行了探讨，发现肺脾虚损在两组患者中均有较高比例，发展“快”患者的Th17/Treg及相关因子表达增高。基于以上，本研究将以蛋白表达差异为切入点，重点对肺脾虚损两类慢阻肺患者外周血差异蛋白进行筛选，探讨该疾病存在发展速度差异的信号通路，重点着手于炎症相关信号通路，并通过流式液相多重蛋白技术、荧光定量PCR技术、Western blot技术检测炎症相关信号通路上的上下游细胞因子表达。试图找出两类患者差异蛋白或相关标志物，用该标志物预测病情发展方向和速度，监测病情，以期达到预防及干预慢阻肺病情“快”患者向“中间状态”或“慢”转化，并为今后的研究提供思路。

临床发现，慢阻肺在发展过程中部分患者病情呈现出不同的发展速度的临床特征。前期课题组对发展“快”“慢”两类患者从中医学特征及分子生物学特征等进方面进行了探讨，发现部分规律。基于前期研究基础，本项目按照肺脾气虚证发展“快”“慢”的慢阻肺诊断标准收集病例进行问卷调查及血液标本的采集。采用iTRAQ 技术鉴定COPD 疾病本身及不同发展速度疾病患者可能相关的外周血差异蛋白。并采用荧光定量PCR 技术、Western blot 技术鉴定并验证各组人群血清中炎性相关蛋白因子的变化情况，从转录调节角度观测影响COPD 发展速度的作用机制。对患者基本信息及检测标本做了统计分析。研究结果显示（1）在患者血浆样品中成功鉴定了683个蛋白，其中394个蛋白被认为是高质量蛋白(95%秘密肽>2)。符合表达差异倍数大于 2 倍（上下调）且 P-value 小于 0.05 筛选标准的蛋白质视为差异表达蛋白质。发展慢组、一般COPD组和发展快组共鉴定出了25,19和27种不同的丰富蛋白(DAPs)。DPAs表达水平的热图显示了四个表达簇。C（COPD） VS Z（正常）：上调14下调 5差异19；K（快） VS Z（正常）：上调 18下调 9差异27；M （慢）VS Z（正常）：上调15下调10差异 25；K （快）VS C（COPD）：上调13下调8差异 21；M（慢） VS C（COPD）上调10下调 9差异 19；K（快） VS M（慢）上调15下调16差异31。（2）15个QD special DAPs提供了一个预测QD表型COPDs的潜在标记候选列表。QD组特异性增高的前5位DAPs分别为抗her3 scFv、脂蛋白A、ptoglobin相关蛋白、推测为特异性蛋白DKFZp686C02220、Pentaxin。对DAPs富集最显著的GO分析是免疫系统过程(GO:0002376)和细胞外泌体(GO:0070062)。这15个QD组特殊DAPs，将有助于进一步挖掘潜在的生物标志物，有效预测COPD的发展表型，并建立优化的治疗策略。通过本研究找出肺脾虚损COPD 发展“快”、“慢”两种不同表型患者外周血可能的生物标志物，为不同类型COPD患者的筛选和针对性治疗提供靶点，以实现发展“快”COPD 向“中间状态”或发展“慢”的转化，发展“慢”COPD 减少年均发作次数、提高生活质量的分级目标。