去势大鼠骨骼肌线粒体中lncRNA表达特征、调控网络分析及中药干预研究

The latest study found that some abnormal expressions occur in Long non-coding RNA (LncRNA) in some diseases, these abnormal expressions and regulations have a fatal influence on such diseases. However，the relationship between the LncRNA and the mechanism of those diseases has not been elucidated，especially in osteoporosis. Mitochondria is the control center of cell activity,and apoptosis. Our previous study found the interplay of osteoporosis and mitochondria in skeletal muscle..This study will firstly adopt LncRNA-m RNA gene chip technology to investigate the expression of LncRNA in mitochondrial in skeletal muscle both in normal and ovariectomized rats,to acquire the specific expression profile and analysis the regulation network，secondly，adopt gene overexpression and silencing technology or related molecular biological methods to investigate how our Chinese herbal compound impact target LncRNA in regulation of preventing and treating osteoporosis by osteoblast，finally to explore the expression of the target LncRNA in human, animal and cell, as well as the connection with osteoporosis, to provide data basis and guidance for the follow-up study.

最新研究发现，长链非编码RNA(LncRNA)在部分疾病中发生了异常，这些异常的表达或调控对疾病有重要的影响。但LncRNA与大部分疾病的发生、发展的关系及作用机制未被阐明，包括LncRNA与骨质疏松之间的关系。线粒体是细胞生命活动的控制中心，也是细胞凋亡的控制中心。我们前期研究发现骨骼肌中线粒体和骨质疏松之间存在着互相影响的关系。本研究①拟采用LncRNA-m RNA 基因芯片技术对正常及去势大鼠骨骼肌线粒体内的 LncRNA 表达情况进行研究，获得其特异表达谱，并进行调控网络分析。③采用基因超表达和沉默技术及相关分子生物学方法，研究中药靶向目标LncRNA 在调控成骨细胞增殖防治骨质疏松症中的作用。探明目标LncRNA在人、动物及细胞中的表达情况，以及与骨质疏松的关联性，为后续骨质疏松症相关 LncRNA 的研究提供数据基础和方向指导。

本项目延续上一个国自然的研究，按计划完成，无调整和变动。本课题主要研究：.①以动物为对象，借助大鼠动物模型，采用LncRNA-mRNA基因芯片技术对正常及去势大鼠骨骼肌线粒体内的LncRNA表达情况进行研究，获得其特异表达谱，并进行调控网络分析。找出目标LncRNA。.②分别以细胞、动物和人为研究对象，采用基因超表达和沉默技术及相关分子生物学方法，研究目标LncRNA在成骨细胞、补肾健脾方干预的去势大鼠动物模型及患骨质疏松症的病人临床样本中的表达及其补肾健脾方防治骨质疏松的作用机制。.研究成果如下：.①完成大鼠骨骼肌和松质骨样本（去卵巢组和假手术组）的测序，从股骨和股四头肌样本中分别筛选出17条和13条差异表达的LncRNA，并采用qRT-PCR验证测序数据；差异LncRNA生物信息学分析显示，主要富集的GO条目说明LncRNA的靶基因多可翻译为有功能的蛋白质，在骨质疏松发生发展过程中起作用；主要富集的通路包括wnt通路，血管平滑肌收缩，磷脂酰肌醇信号通路。.②完成骨质疏松症患者和非骨质疏松症者骨骼肌和松质骨样本的高通量测序，筛选出差异表达LncRNA，并采用qRT-PCR验证测序数据。然后对差异LncRNA进行生物信息学分析。.③利用去卵巢大鼠模型，完成补肾健脾活血方对去卵巢大鼠成骨活动、骨细胞凋亡影响的研究，发现补肾健脾活血方可以通过激活BMP2/Smad信号通路、Wnt/β-catenin信号通路等经典通路对大鼠的骨密度、骨微结构、骨病理改变、骨生物力学等的影响。.④利用腺病毒构建基因超表达和沉默细胞模型，完成目标LncRNA在成骨细胞中的表达及补肾健脾活血方对其影响的作用机制。发现腺病毒转染后成骨细胞活性增殖分化矿化和成骨相关蛋白、Bcl凋亡家族基因蛋白的表达均受到影响。补肾健脾活血方可抑制因目标LncRNA沉默而引起的细胞活性、成骨矿化程度和成骨相关蛋白、抑凋亡蛋白表达的降低，能提高目标LncRNA过表达时的细胞活性、成骨矿化程度和成骨相关蛋白的表达。.本项目丰富了骨质疏松症基因层面上的研究，为从微观研究探索证型本质提供了实验依据。补充了补肾健脾活血方防治骨质疏松症上的理论及实验依据，用于指导临床必将为医患双方从中医方面诊治骨质疏松症带来显著的便利，具有重要的理论指导意义和推广应用价值。