自交不亲和信号传递因子ARC1相互作用蛋白的筛选及功能分析

自交不亲和性（SI）是植物采取的一种避免自交的策略，在长期进化过程中具有重要的作用。芸苔属SI反应的主要部位是柱头乳突细胞。当花粉中的SCR配体与柱头中的SRK受体特异性地识别后，激活SRK的胞内激酶域。ARC1，一个具有U-Box结构域的E3泛素连接酶，是SRK下游的一个正向调控因子，特异性地识别某些下游底物，通过26S蛋白酶体将其降解从而导致SI反应，但目前ARC1的下游底物尚不清楚。在本项研究中，通过构建柱头的酵母双杂交cDNA文库，利用酵母双杂交系统筛选ARC1相互作用的蛋白质；通过RACE方法获得基因全长并进行序列及表达分析；通过免疫共沉淀、pull-down、亚细胞共定位及生物信息学等方法，进行蛋白质间的相互作用及结构域分析；通过体外泛素化实验检测ARC1对筛选到的蛋白质泛素化的水平，免疫印迹的方法检测筛选到的蛋白质在授粉过程中的水平变化，从而阐释筛选到的蛋白质在SI上的功能。

ARC1作为S位点受体激酶的下游组分，在芸苔属自交不亲和信号通路中起正向调控因子的作用。在本项课题研究中，为了分离和鉴定ARC1的底物或调控因子，我们利用酵母双杂交系统来筛选ARC1相互作用的蛋白。以羽衣甘蓝S13bS13b自交不亲和系为材料，提取柱头的总RNA，利用CytoTrap XR 建库试剂盒构建羽衣甘蓝柱头cDNA文库。原始文库的库容量约为2.5×105，扩增后的文库库容量约为4×108。文库的重组率为96 %，插入片段大小在0.4-3.0 kb之间，平均长度约0.8 kb。将羽衣甘蓝ARC1全长克隆到酵母载体pSOS中，构建诱饵蛋白pSOS-BoARC1。将pSOS-BoARC1和pMYr-柱头cDNA文库共同转化酵母细胞，通过对1×106 个克隆的筛选，从中获得10个阳性克隆。序列分析表明，这10个阳性克隆编码JDP1部分氨基酸序列。JDP1全长cDNA序列为1326 bp，包含73 bp的5′非编码区、218 bp的3′非编码区和一个长度为1035 bp的开放读码框，对应编码一个含有344个氨基酸残基的蛋白质，相对分子质量约为38.4 kD，理论等电点为7.04。蛋白结构域分析显示，JDP1的N端JDP1（1-68）含有一个J结构域，而C端JDP1（69-344）未在数据库中找到相似的结构域。JDP1的mRNA在茎、叶、花瓣、花药、柱头、花柱和子房中均检测到表达；而且JDP1蛋白也在茎、叶、花瓣、花药、子房、花柱和柱头中表达。在酵母双杂交和体外结合实验中发现，JDP1（69-344）能够与ARC1相互作用。在拟南芥原生质体细胞内，JDP1（69-344）能够影响BoARC1的定位，并且共同定位细胞膜上，而JDP1全长和JDP1（1-68）的不能影响BoARC1的定位变化。这说明JDP1的C端介导了与ARC1的相互作用，而N端调控与ARC1的相互作用。此外，在授粉实验中，JDP1的蛋白质水平在亲和授粉后45 min内一直增加，而在自交不亲和授粉中JDP1在30 min后开始下降，说明JDP1可能在自交和异交授粉过程中起着不同的作用。从目前所获得的实验结果，我们认为JDP1可能通过调控ARC1的活性来参与自交不亲和信号通路。