基于Ca2+/CaM-CaMK-CREB信号通路研究五子衍宗丸治疗少弱精症的作用机制

少弱精症是男性不育的常见病因，也是男科的治疗难题，经典补肾方五子衍宗丸治疗该病有着确切疗效和独特优势。本课题以该方为研究对象，以精子活力-线粒体结构-生殖细胞凋亡与Ca2+密切相关联为理论基础，以钙离子稳态调节的Ca2+/CaM-CaMK-CREB信号通路为切入点，系统研究该方对少弱精症模型动物生殖细胞Ca2+、cAMP含量，CatSper蛋白表达，线粒体超微结构与功能，性激素水平、以及生殖细胞凋亡调控机制等方面影响，进而提出"促进生殖细胞Ca2+内流，并维持其稳态是补肾法治疗少弱精症的核心"的理念，全面分析该方对生殖细胞CaM、CaMK、CREB蛋白表达影响以及在钙稳态调节中的关键作用，以期寻找其治疗机制。本课题研究不仅为临床遣药组方提供了实证依据，而且从"钙离子稳态调节"角度揭示中医"补肾法"治疗少弱精症的科学内涵，为"肾藏精，主生殖"的中医理论研究提供新视角。

本课题按计划书的要求，认真开展实验，主要研究目标已基本完成项目。采用灌服雷公藤多苷30mg/kg/d，连续8周，制备少弱精症模型大鼠；模型大鼠连续给予五子衍宗丸水提液30天后，分别观察五子衍宗丸对模型动物精子密度、精子活力影响；提取分离精子，采用流式细胞仪和原子吸收光谱仪测定精子胞浆及线粒体Ca2+含量的变化；采用荧光流式细胞技术（JC-1染色）测定其对精子线粒体膜电位（MMP)水平的影响（JC-1+%）；通过透射电镜观察了精子线粒体超微结构的改变。结果发现：大鼠连续灌服雷公藤多苷8周后，精子的密度和活力都明显下降，精子胞浆Ca2+含量均明显下降，与正常组比有显著性差异，线粒体Ca2+含量也有下降趋势。少弱精症模型大鼠精子线粒体JC-1+%明显下降，精子外膜松散、变性，线粒体肿胀、大小不一、线粒体膜不完整，轴丝结构不清或出现断裂。连续灌服五子衍宗丸30天后，能明显增加模型动物精子密度、显著改善精子活力；能明显增加模型动物精子的胞浆和线粒体中Ca2+含量；显著提高精子线粒体膜电位，增加JC-1+%，使精子外膜及线粒体膜结构完整，减少线粒体肿胀，保护轴丝及微管结构。结论：五子衍宗丸能明显改善少弱精症模型大鼠的精子质量，对少弱精症有良好的治疗作用，增加精子胞浆Ca2+含量并维持其稳态以及保护精子线粒体结构与功能的完整是五子衍宗丸治疗少弱精症的主要机制。. 目前在《JTCM》杂志发表论文1篇（SCI）、另一篇文章已被《中华男科学杂志》录用、待编。