基于微透析及CaM调控的知母盐炙增强滋肾阴降相火作用机制研究

Processing theory was one of the key issues in the research and development of traditional Chinese medicine. Long-term clinical practice showed that Anemarrhena processed with salt could enhance its effect of nourishing yin to lessen fire, however, this processing synergistic mechanism still lacks of modern scientific support. According to the problems mentioned above and the preliminary research foundation we have, the subject studies the dynamic changes of active ingredient group of crude and salt processed Anemarrhena in the blood and the target tissues reletated to the "kidney", by multilocus synchronization microdialysis combined with LC-MS/MS technology, based on the quantitative and qualitative changes of chemical composition between crude and salt processed Anemarrhena. Combining the impact of crude and salt processed Anemarrhena on the NEI network system and energy metabolism of kidney yin-deficiency syndrome animal model, we will systematic analysis the enhanced nourishing yin to lessen fire effect of Anemarrhena after processed with salt. We study the expression of landmark protein Calmodulin (CaM) in HPA and HPG by Westorn-blot and RT-PCR technology, to clarify the key mechanisms of the enhanced nourishing yin to lessen fire effect of Anemarrhena after processed with salt at the molecular level. This project combined the own internal changes of the active ingredient group in Anemarrhena with the dynamic process in vivo, and contacted the whole pharmacological effect changes with molecular biology mechanisms, to systematically study the scientific connotation of the strengthen of nourishing yin to lessen fire effect and enhance of the kidney tropism of Anemarrhena after stir-heating with salt solution in overall recognition. Closely linked to the holistic concept of Chinese medicine, the project will establish a new idea in research of the mechanism that stir-heating with salt solution can enhance the kidney tropism of Anemarrhena, thus to promote the modern development of the processing and channel entry theory of traditional Chinese medicine.

中药炮制理论是中医药研究与发展中的关键问题之一，知母盐炙入肾增强滋阴降火之功为历代医家所认可，但其增效作用机制尚缺乏现代科学理论支撑。针对上述问题，本项目以效应物质变化为基础，采用多位点同步微透析联用LC-MS/MS前沿技术，研究知母盐炙效应成分群在血液和肾相关靶组织中的动态变化，结合盐炙对肾阴虚模型NEI网络系统及能量代谢的影响，对盐炙增强其滋阴降火作用进行系统评价。采用Western-blot、RT-PCR等现代技术，研究肾阴虚标志性蛋白CaM及mRNA在HPA、HPG中表达情况，从细胞分子水平研究阐明知母盐炙增强滋阴降火作用的关键机制。项目将知母盐炙对效应物质的改变与其在体内动态变化相结合，整体药效变化与分子生物学机制相结合，整体辨识、系统分析盐炙增强知母滋阴降火作用的科学内涵。紧扣中医药整体观理论，创新性地建立知母盐炙入肾机制研究新思路，深化传统炮制及归经理论的纵深发展。

中药炮制理论是中医药研究与发展中的关键问题之一。长期的临床实践表明，知母盐炙后可引药入肾，增强滋阴降火的作用，但其作用机制尚缺乏科学理论支撑。本项目选择从知母盐炙前后物质基础及其变化、主要成分在体内的药代动力学及组织分布的动态变化、知母盐炙后对肾阴虚模型NEI网络系统及能量代谢的影响，对上述理论进行探索评价。本项目取得的主要研究结果如下：1、对知母进行了系统的文献研究整理；2、收集了河北、安徽等主产地在内的7个产地9批次知母药材，建立了HPLC-DAD-ELSD同时测定了知母药材中主要黄酮类和皂苷类成分的方法并对上述样品进行含量测定；3、建立了UHPLC-QTOF-MS的方法对知母进行全面的多组分定性分析，通过成分保留时间、质谱信息，对比部分对照品和文献报道，从知母中鉴定了89个化学成分，包括8 个环肽，13个黄酮 (11个酮)，45个甾体皂苷，15个脂肪酸，3个木脂素和5个其它成分，其中环肽类成分和双酮类成分首次在知母报道；4、采用HPLC-MS对知母中主要成分进行了含量测定。采用主成分分析和聚类分析研究知母盐炙前后的成分变化。结果表明，生、盐知母被明显分为了两组，表明生盐知母的化学成分发生了明显的改变。5、生、盐知母主要成分的药代动力学研究表明，比较了盐炙对知母有效成分在大鼠体内的药动学行为影响；6、考察了知母主要成分盐炙前后在大鼠组织中的分布。结果表明，其成分主要分布在大鼠子宫、肝和肺组织中，其次为肾、心和睾丸，在脾中的分布浓度最低，盐炙前后主要成分组织分布变化与其物质基础变化相关。7、知母盐炙后，对肾阴虚大鼠模型的环核苷酸系统、肾上腺皮质功能、免疫系统、能量代谢均产生一定的改善作用，证明了盐炙合理性，但是对其物效关系及作用机制仍需进一步探索；8、肾阴虚大鼠给予生、盐知母后，其HPA、HPG中CaM的表达会下降，盐知母的作用略强；9、研究建立了HPLC 指纹图谱方法，用于知母及其炮制品的质量控制。知母炮制后指纹图谱发生了明显变化，对 α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用也明显减弱。10、知母皂苷B-II具有改善棕榈酸诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗作用，同时能够降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的血糖，同时改善糖尿病肾病的并发症。本项目将知母盐炙对效应物质的改变与其在体内动态变化相结合，整体药效变化与分子生物学机制相结合，系统分析盐炙增强知母滋阴降火作用的科学内涵。