功能性甜菊糖苷的酶法制备及其分子识别机制研究

糖基转移酶催化转糖基反应中的反应、位置、底物等选择性问题，在分子层面上可以归结到分子间的相互识别和亲和，亦即酶对受体分子中多个结合位点以及供体分子的识别和亲和的差异性问题。这种识别和亲和的行为特征直接决定了转糖基产物的结构和性能。本课题将以天然甜菊苷St的酶法改性为研究载体，深入研究糖基转移酶特别是环糊精转移酶催化糖基化反应的分子识别机制。通过研究糖基转移酶多种功能的差向表达、酶对糖基供体和受体St分子中多个结合位点的识别，以及影响其识别和亲和行为的微环境刺激与应答（包括溶剂环境、其它物理和化学环境的调控），借助光谱、多维NMR和微量量热技术，联系二阶微扰理论计算，交互分析酶蛋白质分子二级构象的弛豫变化，从热力学和动力学两方面认识其分子识别机制。与此同时,结合基因工程筛选、发掘出一些新的糖基转移酶，利用或改变其特异性的分子识别，将St定向改造成优质甜味剂和其它功能性甜菊糖苷。

本课题以天然甜菊苷St的酶法改性为研究载体，深入研究糖基转移酶特别是环糊精转移酶催化糖基化反应的分子识别机制。通过研究糖基转移酶多种功能的差向表达、酶对糖基供体和受体St分子中多个结合位点的识别，以及影响其识别和亲和行为的微环境刺激与应答（包括溶剂环境、其它物理和化学环境的调控），借助光谱、多维NMR和液质联用，从热力学和动力学两方面认识其分子识别机制。与此同时, 结合基因工程筛选、发掘出一些新的糖基转移酶，利用或改变其特异性的分子识别，将转苷性能差的酶用于水解催化，获得了新的催化功能，催化合成出自然界存在但是稀少的功能性糖苷如甜菊双糖苷等。将St定向改造成优质甜味剂和其它功能性甜菊糖苷，对酶转化产物甜菊糖苷的甜味特性和生物活性进行了评价。.研究发现, 环糊精葡萄糖基转移酶催化的甜菊糖转苷反应中，pH微环境对分子识别的改变行为与关键氨基酸的质子化需求相对应，佐证了路易斯酸-亲核双取代机理。通过简单的非示踪反应设计，在环糊精葡萄糖基转移酶对底物的特异性分子识别上有了突破性进展，发现其催化St转苷的机理或途径是因底物而异的，环糊精葡萄糖基转移酶Toruzyme3.0L对底物分子有特异的识别作用；首次阐明了环糊精葡萄糖基转移酶催化淀粉和甜菊苷转苷反应的机理；首次阐明了微波辅助下糖基转移酶的选择性改变的机理。应用这些原理，已经获得一批口感良好的改性甜菊糖和有抑制癌症作用的甜菊糖衍生物，衍生出一些新的课题包括企业合作项目。