血浆游离DNA甲基化分析对乙肝病毒相关肝细胞癌的早期诊断和预警研究

In china most of the hepatocellular carcinoma(HCC) cases were developed from Chronic hepatitis B and the hepatitis B virus (HBV)-positive cirrhosis. Early diagnosis is essential for the treatment and prognosis of HCC, however we still lack ideal biomarkers for early diagnosis and pre-warning of HCC. The aberration of DNA methylation is the most common epigenetic phenomenon during the process of carcinogenes and it also exists in Chronic hepatitis B. However,there are still no research done to clarify the relation between aberrant DNA methylation and the malignant transformation of Chronic hepatitis B. Furthermore, detecting the methylation status of specific loci in serum cell-free DNA is a promising way to diagnose hepatocellular carcinoma in early stage. This project aims to 1) establish Methylomes of the cell-free serum DNA from healthy people, as well as patients with Chronic hepatitis B, cirrhosis and hepatocellular carcinoma; utilize bioinformatics to analyze the data acquired in ,and find the abnormally methylated loci associated with carcinogenesis in serum DNA from Chronic Hepatitis or hepatitis B virus (HBV)-positive cirrhosis through comparation of the methylomes; validate the abnormally methylated loci acquired in by lateral cohort and longitudinal cohort.; find DNA methyaltion markers which can predict the risk of HCC in patients with Chronic hepatitis B or hepatitis B virus (HBV)-positive cirrhosis; and thus facilitate to follow up those patients, make early diagnosis of HCC, and give insight into the exploration of new drugs which can block the aggaravation of Chronic hepatitis B or cirrhosis.

慢性乙肝-肝硬化-肝细胞肝癌是中国最为常见的肝癌发生过程，肝癌早期诊断对其治疗及预后至关重要，但目前缺少理想的早期诊断和预警性标志物。DNA甲基化是导致肝癌发生的重要表观遗传学机制，在慢性乙肝阶段就已发生，但其甲基化状态与肝癌发生相关性研究很少。慢性乙肝、肝硬化、肝癌均释放肝细胞基因组DNA进入外周血形成血浆游离DNA，故血液检测其特定位点甲基化状况将是极具价值的肝癌早期检测和预警手段。我组前期建立正常、慢性乙肝、乙肝肝硬化、肝癌4个人群外周血游离DNA全基因组甲基化谱式得到一批病程阶段差异的异常甲基化基因；本项目将寻找慢性乙肝或肝硬化病人血浆游离DNA中与肝癌发生相关的异常甲基化基因；经横向队列和纵向回顾队列验证；为慢性乙肝、肝硬化提供肝癌预警性生物标志物，对肝癌高危人群进行肝癌风险性评估，随访监控，肝癌早期诊断，进一步提供可能逆转乙肝发展为肝癌的干预药物靶标的基因功能基础研。

本项目运用 Methylcap-Seq 建立了正常人、乙肝患者、肝硬化患者、乙肝阳性干细胞肝癌患者、非小细胞肺癌患者，5个血浆游离DNA(CFDNA)全基因组甲基库，经BLAM和MACS运算建立了全基因组DNA甲基化谱式，聚类分析结果显示，5组样本的甲基化谱式相似度符合肝脏受HBV侵袭后的肝癌发生过程，得到了包括涉及基因 promotor、 5UTR、 mir、 Enchancer、 exon 的甲基化差异区域（DMR），并进一步确定了乙肝、肝硬化、干细胞肝癌、非小细胞肺癌和HBV关联病程相关的DMR以及DMR关联的基因。经肝癌等组织样本筛选，确定了33个候选DMR。在另一组独立血浆样本中，包括健康组(37人), HBV组(40人)，HBV相关肝硬化组(40人)，HBV相关肝癌组(47)，建立并运用multiplex-Bisulfite PCR/seq平台，对微量的血浆cfDNA，进行单样本多位点，最终多样本高通量单碱基分辨率的特定区域甲基化水平定量。我们首次发现包括ZNF300 的 CpG6、SLC22A20的 CpG3和5、 SHISA7的CpG1, 5 和6 ，这3个基因相关DMR区域内的6个CpG位点在HBV相关肝癌进程中发生甲基化水平异常上升，且与肝癌发生进程显著相关。上述关于血清cfDNA甲基化水平的研究提供了可以验证的假设，即慢性HBV感染的肝细胞触发伴随着HBV相关HCC癌变过程的一系列DNA甲基化紊乱，异常DNA甲基化（包括甲基化水平上升和下降）的逐渐积累。以上DNA甲基化异常改变位点在HBV相关肝细胞肝癌中出现的早期性和易于连续检测和追踪随访血浆游离DNA相结合，在慢性乙肝患者和肝硬化患者中建立与肝癌发生相关的潜在肝癌危险性的预测体系，对相关高危人群或癌前病变人群中肿瘤的发生风险作出前瞻性评估，从而对肝癌发生的高风险人群定期筛查，对危险度高的患者加强随访监控，使其接受可能延缓和逆转肝癌发生治疗；对已进展为肝癌的患者能够尽早做出诊断，使其得到较长的有效治疗时间窗口。