基因组DNA中 5-羟甲基胞嘧啶的系统分析及其生物功能研究

The methylation of cytosine in DNA plays a crucial regulation role in life processes. Recently, it has been found that methylcytosine (mC) could be converted to hydroxymethylcytosine (hmC). The biological functions of hmC is now unclear. Lack of suitable analytical methods for hmC detection seriously hinders the process for the studies of hmC biological functions. The hmC can covalently bound glucose molecule with the catalysis of β-glucosyltransferase. In this project, we want to study and establish the in situ fluorescence analysis of hmC in chromosomes and hmC assay in single genomic DNA molecule by using fluorescent molecule probes or nanoparticle probes modified with boric acid groups based on the specific recognition between boric acid group and glucose molecule. We also plan to separate and enrich the DNA fragments containing hmC with magnetic microspheres modified with boric acid groups and to determine the sequences of the DNA fragments with massively parallel sequencing techniques in order to obtain the hmC distribution map in genomic DNA. Based on ligation-based PCR and ligase chain reaction, we will develop the highly sensitive methods for direct detection of hmC in genomic DNA. With this project, we can establish a systematic analysis platform for hmC detection, which can push the process of biological function studies of hmC in genomic DNA. The biological functions of hmC in cancer generation and development and the diagnosis of cancers by using hmC as new biomarkers will also be investigated in this project.

DNA中甲基化的胞嘧啶（mC）在生命过程中起着至关重要的调控作用。近年来发现mC可转化为羟甲基胞嘧啶（hmC），但其生物功能还不清楚。缺乏合适的hmC分析方法严重阻碍了hmC生物功能研究的进程。本项目拟利用β-葡萄糖转移酶使hmC与葡萄糖共价结合，基于硼酸基团与葡萄糖之间的特异性识别，以硼酸修饰的荧光分子及纳米粒子探针，研究建立染色体DNA中hmC原位荧光分析及基因组DNA中hmC的单分子分析方法；以硼酸修饰的磁性微球分离、富集含hmC的DNA片段，并进行高通量测序，绘制基因组DNA中5hmC的分布图谱；以连接PCR和连接酶链式反应建立能直接检测基因组DNA中hmC的高灵敏度分析方法。从而形成一个系统分析hmC的技术平台，促进hmC的生物功能研究的进展。同时探讨hmC在癌症发生过程中的作用，以及以hmC为新标志物进行癌症诊断分析的可能性。

按照申请书所提出的研究任务，本项目围绕羟甲基胞嘧啶（5hmC）的检测及其生物功能开展了系统深入的研究，结合基于连接反应的核酸扩增技术（包括聚合酶链式反应（PCR）和环介导等温扩增技术（LAMP）等），研究解决了高灵敏度、高特异性区分识别基因组DNA中胞嘧啶（C）、5-甲基胞嘧啶（5mC）和5hmC这一关键科学问题。本项目按计划完成了任务，建立了基于酶切-KRuO4-NaHSO3处理区分5hmC DNA的方法，利用甲基化敏感的限制性内切酶HpaII切断含C的双链DNA，5hmC经KRuO4和NaHSO3处理后变为U，而5mC保持不变，因此将5mC和5hmC的差异变为了DNA中5mC与U的单个碱基差别。创新性地针对处理后的5hmC DNA设计探针并进行连接反应，连接产物经PCR和LAMP扩增后，实现了5hmC的特异性检测。进一步设计了过氧钨酸钾一步处理识别5hmC的方法，过氧钨酸钾可以直接将5hmC氧化成三羟基胸腺嘧啶（thT），而C与5mC保持不变。thT与腺嘌呤（A）配对，由此可经过一步氧化反应从C、5mC及5hmC中有效识别5hmC，结合基于错配的连接LAMP反应和单个微球的富集技术，研究实现了5hmC的高灵敏度、高特异性分析检测，可检测低至100 aM的5hmC DNA，能够在样品中有效识别1% 5hmC DNA，所研究建立的分析方法选择性和灵敏度能满足临床分析检测实际样品的要求；并将所建立的分析方法应用于实际样品分析，取得了满意的结果。随后，我们构建了基于单个微球的信号扩增及富集机制应用于miRNA和蛋白激酶的超高灵敏度检测，利用基于连接反应的液滴式数字PCR分析方法实现了单细胞中miRNA的精确定量以及mRNA突变检测。基于高效的核酸扩增技术，本研究项目拓展到了microRNA、mRNA剪接变体、DNA甲基化以及重要的癌症蛋白标志物的高灵敏度、高选择性分析研究，取得了一系列创新性研究成果。