PrxⅡ蛋白在甲醛致小鼠骨髓细胞损伤中作用机制的研究

Formaldehyde can induce children myeloid leukemia, oxidative stress may be one of the reasons. Our previous study found that, formaldehyde could induce bone marrow cells injury of mice, increase H2O2 content, and decrease the expression of Prx II protein which acts as a biological marker of endogenous oxidative stress, but the exact mechanism is not clear. In this study, we use formaldehyde as the object of study. In vitro, by using RT-PCR, Western blot, immunofluorescence technique, we observe the expressions of Prx II protein and the key proteins of PTEN/PI3K/Akt signal transduction pathway; by using RNA interference technology and CoIP to clear the role of Prx II protein and the relationship between Prx II protein and PTEN/PI3K/Akt signal transduction pathway; we also use inhibitors of PI3K to investigate whether Prx II protein is involved in the process of the bone marrow cells injury induced by formaldehyde through PTEN/PI3K/Akt signal transduction pathway. In vivo, we use dynamic inhalation contamination device and Prx II protein inhibitor to investigate the effects and mechanisms of Prx II protein and PTEN/PI3K/Akt signal transduction pathway. This study will clarify the relationship of formaldehyde and leukemia from a new angle, and provide a new idea and a new drug target for leukemia prevention and therapy.

甲醛暴露能诱发儿童髓性白血病，氧化应激可能是原因之一。我们前期研究发现，甲醛能诱导小鼠骨髓细胞损伤，H2O2含量增加，作为氧化应激内源性生物标志物的PrxⅡ蛋白表达降低，但确切机制尚不清楚。本课题以甲醛为研究对象，体外采用RT-PCR 、Western blot、免疫荧光等技术，观察PrxⅡ蛋白及PTEN/PI3K/Akt信号通路关键蛋白的表达变化；应用siRNA及免疫共沉淀技术明确PrxⅡ蛋白的作用及与PTEN/PI3K/Akt信号转导通路的关系；采用PI3K抑制剂，探讨PrxⅡ蛋白是否通过PTEN/PI3K/Akt信号通路参与甲醛诱导的骨髓细胞损伤过程。体内采用动式吸入染毒方式，应用PrxⅡ蛋白抑制剂，探讨PrxⅡ蛋白及PTEN/PI3K/Akt信号通路在甲醛诱导骨髓细胞损伤中的作用机制。本课题将从新的角度阐明甲醛与白血病的关系，为预防和治疗白血病提供新思路和药物作用新靶点。

甲醛暴露能诱发儿童髓性白血病，氧化应激可能是原因之一。申请者前期研究发现，甲醛能诱导小鼠骨髓细胞损伤，H2O2含量增加，作为氧化应激内源性生物标志物的PrxⅡ蛋白表达降低，但确切机制尚不清楚。因此，本课题通过建立不同剂量甲醛体外染毒小鼠（BALB/c, 6-8周龄）骨髓细胞培养体系，检测小鼠骨髓细胞存活率，ROS含量，细胞周期，凋亡及PrxⅡ表达，探讨PrxⅡ蛋白在甲醛致小鼠骨髓细胞损伤中的作用；采用RNA干扰技术降低PrxⅡ表达，以100 μmol/L 的甲醛作为暴露剂量，检测干扰后的小鼠骨髓细胞存活率，ROS含量，细胞周期，凋亡及PrxⅡ表达。结果表明，甲醛可降低PrxⅡ基因和蛋白水平，引起骨髓细胞氧化性损伤；抑制PrxⅡ表达水平，加重甲醛的骨髓毒性。这一结果说明，PrxⅡ蛋白参与了甲醛诱导的骨髓毒性过程，是甲醛诱导白血病的重要因素之一。PTEN/PI3K/Akt 信号转导通路对白血病的发生、发展及预后具有重要的作用，其通路蛋白表达异常，可引起血液系统恶性疾病的发生。随后，课题组采用流式细胞术，RT-qPCR, western blot 等技术，检测不同剂量甲醛对PTEN/PI3K/Akt 信号转导通路关键蛋白的表达情况，并应用PI3K抑制剂（LY294002）抑制该信号转导通路，检测骨髓细胞存活率, ROS含量, 细胞周期及凋亡。结果发现，PTEN/PI3K/Akt信号转导通路参与了甲醛诱导的骨髓毒性。文献报道，PrxⅡ能可逆性失活使H2O2积累到一定程度，氧化PTPs 和PTEN 活性位点上的-Cys 使PTPs 和PTEN 失活，引起Akt 上游的PIP3增加，触发下游信号事件的发生，导致白血病等疾病的发生。因此，课题组采用RNA 干扰技术，降低PrxⅡ表达后，检测PTEN，PI3K，Akt的蛋白表达及mRNA，发现PTEN的表达降低，而PI3K和Akt的表达升高；随后，我们又采用PI3K抑制剂抑制PTEN/PI3K/Akt 信号转导通路，检测PrxⅡ的表达，结果发现，PrxⅡ的蛋白表达及mRNA降低。说明PrxⅡ与PTEN/PI3K/Akt 信号转导通路有关联。体内实验，我们应用PrxⅡ蛋白抑制剂，采用甲醛吸入染毒方式，检测骨髓细胞ROS含量, 细胞凋亡，DNA损伤。结果进一步表明，PrxⅡ蛋白在甲醛诱导的骨髓毒性中起了重要作用。