CDK5磷酸化RKIP介导的神经元凋亡在神经系统发育与疾病中的作用

CDK5通过对不同的信号传导通路上靶蛋白的磷酸化来参与脑发育过程中神经细胞的分化、迁移及突触建立等生理过程的调节，并在神经系统损伤、退行性疾病等病理过程中起重要作用。研究表明CDK5激酶过度激活与发育和疾病过程中生理性和病理性的神经元凋亡密切相关，但与其相关的信号通路和分子机理目前尚不清楚。本项目计划对在神经系统发育及Alzheimer氏病中CDK5介导的Raf激酶抑制蛋白（RKIP）磷酸化在神经元凋亡中的作用机制做深入的探讨。主要研究内容是鉴定CDK5激酶磷酸化RKIP蛋白的位点；验证CDK5磷酸化RKIP蛋白使其由与Raf-1结合转向与GRK2结合，并过度激活Ras/Raf/MEK/ERK信号通路；探讨CDK5磷酸化RKIP介导的神经元凋亡在神经系统发育及Alzheimer氏病中的作用；研究RKIP降解生成海马胆碱能神经刺激肽（HCNP）的机制以及HCNP对神经元分化和凋亡的影响。

目的：Raf激酶抑制蛋白（RKIP）是ERK/MAPK通路主要的抑制因子，通过与Raf-1结合抑制后者活性及通路信号的传递。RKIP表达的下调已被证实参与多种恶性肿瘤及阿尔兹海默氏症等疾病的发生与发展过程，但RKIP下调的分子机制尚不明确。本研究试图探讨RKIP蛋白与细胞周期素依赖性激酶5（CDK5）的关系，进一步研究RKIP下调的机制，以及与RKIP相关的机制在帕金森病（PD）中的作用。.方法：（1）体外激酶反应、磷酸化抗体制备及体内检测等方法验证RKIP是否为CDK5的磷酸化底物；（2）在原代培养神经元中采用Western blot、荧光素酶报告基因等技术检测ERK/MAPK通路活性；（3）神经元降解模型、溶酶体提取及体外结合/摄取等实验检测RKIP蛋白的降解途径及鉴定介导降解的关键序列；（4）在MPTP诱导及转基因鼠帕金森病模型中检测RKIP磷酸化、ERK通路活性等指标与神经元死亡率的相关性。.结果：（1）CDK5磷酸化RKIP蛋白的Thr42位点；（2）RKIP磷酸化后与Raf-1解离，继而导致ERK/MAPK通路激活；（3）RKIP磷酸化引起自身降解，即通过分子伴侣Hsc70识别其179-183位“KLYEQ”序列，然后经分子伴侣介导的自噬途径（CMA）降解；（4）RKIP磷酸化及ERK通路过度激活引起神经元的细胞周期再进入现象，参与介导帕金森病中多巴胺能神经元的死亡。.结论：CDK5磷酸化RKIP并诱发其自身降解，导致ERK通路过度激活，继而引起神经元细胞周期再进入，最终参与介导帕金森病中神经元的死亡。