LPS刺激人牙髓干细胞产生的外泌体在牙髓再生中的作用

The dental-pulp like tissue regenerated by tissue engineering without dental pulp stem cells (DPSCs) had been proved existing differences both in structure and function compare with dentin-pulp complex. Exosome (EXO) is the nano-sized extracellular vesicles released by various original cells. It packed with cell-type specific combinations of proteins, lipids, coding, and non-coding RNAs. EXOs play a pivotal role in the cell-to-cell communication process by shuttling active cargoes and could replace the original cells for tissue repairing and regeneration. Compared with original cells, EXO is characterized by low immunogenicity capacity, easy storage and easier manipulate. Exosomes have their own distinct functional properties which depend on the type and physiological or pathological conditions of original cell. This project will isolate EXO from DPSCs cultured under odontogenic conditions with or without lipopolysaccharide. The expression profiling of DPSC-EXO miRNA will be analyzed. The potential of DPSC-EXO to induce odontogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells will be evaluated in vitro. We also study the dental pulp regeneration capacity of DPSC-EXO combined with evoking apical bleeding or with implanting SDF-1 in vivo, which supposed to provide evidence for applying DPSC-EXO in dental pulp regeneration instead of DPSCs.

无干细胞移植的牙髓再生技术由于缺乏牙髓干细胞（dental pulp stem cells,DPSCs）的参与，再生的组织在结构和功能方面仍然达不到理想的目标。外泌体（exosome, EXO）是一种可由多种细胞分泌的纳米级小囊泡，通过传递其携带的蛋白质和核酸等生物活性物质介导细胞间的信息交流，可替代母体细胞发挥生物学作用，与母体细胞相比具有稳定易保存、低免疫原性等优点，发挥的功能作用取决于母体细胞的类型和分泌时的生理状态。本项目将采用LPS在诱导成牙条件下刺激DPSCs，探讨LPS对DPSCs分泌的EXO携带的生物信息所产生的变化和影响，通过在体外研究DPSC-EXO诱导骨髓间充质干细胞成牙本质细胞向分化的作用，动物体内评价DPSC-EXO在牙髓血运重建技术中的应用或与趋化因子SDF-1的协同作用，为DPSC-EXO替代DPSCs用于牙髓再生治疗提供依据。

基于组织工程的牙髓再生有两种方式：干细胞移植和无细胞移植。两种方式各具优劣之处，无细胞移植形式的再生性牙髓治疗已经在临床上广泛应用。研究已经证明无论是通过根尖损伤刺激出血，还是通过在无髓根管内植入无细胞含趋化因子的生物活性支架，均可诱导体内干细胞归巢到根管中，并形成新生组织，但新生组织的组织结构与正常牙髓组织相比存在较大差异。本研究通过利用外泌体携带母细胞生物学特性的特点，用牙髓干细胞源性外泌体（DPSCs-EXO）替代牙髓干细胞(DPSCs)移植，应用于非细胞移植的牙髓再生，研究外泌体对归巢的干细胞、新生组织组织结构的影响以及可能的作用机制，为外泌体的临床应用提供科学依据。.研究内容：大量的研究证实轻度炎症状态下的DPSCs具有更强的生物学功能，本研究利用LPS作用于DPSCs，模拟DPSCs在轻度炎症下的激活状态，收集该状态下分泌的外泌体（L-EXO），与DPSCs在正常状态下分泌的外泌体（N-EXO）相比较，通过体内、体外研究，评价L-EXO的生物学特性和在牙髓再生过程中所发挥的生物学效应，并通过miRNA差异基因分析进一步探讨N-EXO及L-EXO在牙髓再生中可能的分子生物学作用机制。.重要结果：①本研究结果显示1µg/mL的LPS作用3天为最适宜条件，DPSCs的生物学能力增强；②超高速离心法与超滤法相结合可提取纯度较高的外泌体，提取后L-EXO中LPS的残留量符合国家和FDA安全标准。LPS作用DPSCs分泌外泌体的量增加；③BMSCs可以胞吞L-EXO及N-EXO。L-EXO及N-EXO可以促进BMSCs的增殖、迁移、分化和成血管能力，与N-EXO相比较，L-EXO作用更明显且作用维持时间更持久；④L-EXO及N-EXO单独或与SDF-1联合，均可促进根管内富含血管的牙髓样组织再生，减少根管内骨样/矿化组织的形成，与N-EXO相比较，L-EXO可促进更丰富的血管形成，新生组织在组织学结构上更接近正常牙髓；⑤L-EXO与N-EXO的miRNA差异基因表达分析，筛选出9条具有显著差异的miRNA。这些miRNA可能靶向多条细胞信号通路，调控血管再生、炎症及神经损伤修复等生理过程，并可能在牙髓再生中起重要调控作用。.结论：轻度炎症状态下的DPSCs外泌体可以促进富含细胞血管、组织结构排列更为有序的类牙髓样组织形成，在牙髓再生性治疗的临床转化中具有较好的前景。