Znhit1介导H2A.V的染色质定位调控细胞凋亡的作用研究

Histone variants, the variant of core histones, mediate the inheritance of epigenetic information and play important roles in the initiation and progression of disease including cancer. The deposition of histone variants on chromatin depends on the function of chromatin remodeling complexes. Our previous study showed that loss of Znhit1, a subunit of chromatin remodeling complexes SWR1/SRCAP, leads to impaired eye during Drosophila eye development. Additional, we found loss of Znhit1 induced apoptosis, which responsible for the damaged eye. The further study showed that loss of Znhit1 caused the H2A.V lost on the Chromatin and down-regulated expression of H2A.V. We also found Knockdown of H2A.V by RNAi or Knockout H2A.V caused impaired eye and induced apoptosis in developing eye. As a result, we hypothesized that Znhit1 regulates apoptosis by mediating the chromatin deposition and expression of H2A.V. The aim of this study was to investigate the mechnism function of Znhit1 and H2A.V in the regulation of apoptosis during Drosophila eye development.

组蛋白变体是核心组蛋白的变异体，介导表观遗传信息的遗传，在癌症等疾病发生和进程中具有重要作用。组蛋白变体在染色质上的定位依赖染色质重塑复合体的作用。我们前期研究发现染色质重塑复合体SWR1/SRCAP亚基Znhit1缺失可导致果蝇成蝇眼发育缺陷，激活细胞凋亡，抑制细胞凋亡可挽救Znhit1突变引起眼缺陷表型。进一步研究发现Znhit1突变导致组蛋白变体H2A.V染色质定位消失和表达水平下调，并且H2A.V的敲低或突变也可导致成蝇眼发育缺陷，激活细胞凋亡。据此我们假设：在眼发育过程中，Znhit1突变改变H2A.V的染色质定位和蛋白的表达，激活细胞凋亡。本课题拟以果蝇为研究模型，探讨Znhit1介导组蛋白变体H2A.V的染色质定位和蛋白的表达，调控细胞凋亡影响果蝇眼发育的作用。

本课题以果蝇作为研究模型探讨染色质重塑因子Znhit1在果蝇成虫盘组织中调控细胞凋亡的作用机制。Znhit1是染色质重塑复合体SRCAP的一个亚基，在果蝇中又称Dmp18，参与染色体上组蛋白H2A和组蛋白变体H2A.Z/H2Av的置换。通过P因子介导的不精确剪接技术，我们获得了Znhit1突变体果蝇，纯合突变体在三龄幼虫晚期致死，其生长发育缓慢，眼和翅膀成虫盘变小甚至消失。在成蝇眼中Znhit1突变可导致眼变小，眼表面刚毛排列紊乱。免疫荧光染色结果显示Znhit1突变导致成虫盘内Cas3*表达激活，TUNEL阳性信号增加，说明Znhit1突变可导致成虫盘发生细胞凋亡。进一步结果显示抑制细胞凋亡可显著挽救Znhit1突变引起的小眼表型。RNA-seq和免疫荧光染色分析发现Znhit1突变后促凋亡因子rpr和hid的转录水平显著上升。由此我们得出结论：Znhit1通过调控促凋亡因子rpr和hid的转录参与成虫盘内的细胞凋亡。鉴于Znhit1具有催化染色质上H2A和H2A.Z置换的作用，我们进一步探讨了果蝇组蛋白变体H2Av在调控成虫盘细胞凋亡过程中的作用。我们发现Znhit1突变后H2Av的表达显著下调且染色质定位消失。敲除或敲低H2Av表达可引起成虫盘发生细胞凋亡。RNA-seq和免疫荧光染色显示H2Av突变上调促凋亡因子rpr和hid的转录，证实Znhit1突变引起的细胞凋亡与H2Av有必然联系。进一步结果显示，在Znhit1突变细胞中过表达H2Av无法抑制成虫盘中细胞凋亡的发生，且过表达的H2Av也不能定位到染色质上，说明Znhit1通过调控H2Av的染色质定位调控细胞凋亡。最后通过CUT&Tag实验我们检测了促凋亡因子rpr和hid转录起始位点处组蛋白变体H2Av、H3K4me3、H3K27me3和H3K27ac的结合情况。结果显示rpr转录起始位点处的H2Av结合少且在Znhit1或H2Av突变后没有发生显著变化，而hid转录起始位点处H2Av的结合显著降低。此外，Znhit1或H2Av突变后rpr和hid的转录起始位点的H3K4me3修饰增加，H3K27me3修饰发生轻微下调。由此，我们认为Znhit1/H2Av通过调控促凋亡因子转录起始位点处H2Av的结合和组蛋白H3甲基化修饰参与基因转录的调节，调节细胞凋亡信号通路。