微管靶向抗肿瘤药物诱导PHD2的磷酸化下调HIF抑制肿瘤生长的机理研究

Microtubule-targeting agents are one of the most clinically successful anti-tumor chemotherapeutics. Previous studies have shown that these agents not only disrupt the dynamic of microtubule but also could robustly down regulate the protein level of HIF-α. However, the mechanism remains to be clarified. Our preliminary work shows that microtubule-targeting agent taxol can induce the phosphorylation of PHD2 on Ser125 site. Mutation of this site dramatically disrupt the downregulation effect of PHD2 on HIF-1α. In this project, we will try to clarify the mechanism how taxol causes the phosphorylation of PHD2 and downregulation of HIF-α, and then to investigate whether and how this regulation influences tumor progression through mice model. The performance of this project may shed a new light on how microtubule-targeting agents down regulate the protein level of HIF-α.

微管靶向抗肿瘤药物是目前临床上治疗肿瘤最成功的化疗药物之一。研究表明，其不仅能破坏纺锤丝-微管的动态平衡，而且能显著下调HIF-α的蛋白水平。然而，其机理仍然是未知的。我们前期研究发现微管靶向抗肿瘤药物能够诱导PHD2丝氨酸125位点的磷酸化。该位点的突变降低了PHD2对HIF-1α的下调能力。在本项目中我们拟进一步探究微管靶向抗肿瘤药物诱导PHD2磷酸化下调HIF-α的分子机理，并结合动物模型阐明这一调节机制在肿瘤发生发展的作用。我们的研究有望阐明微管靶向药物下调HIF-α的分子机理，填补PHD2翻译后修饰领域的空白。

脯氨酸羟化酶2(Prolyl Hydroxylase Domain-Containing Proteins, PHD2)在机体氧气应激过程中具有重要作用。在研究中我们发现使用阻滞细胞周期的抗癌药如紫杉醇(taxol)能明显的诱导PHD2发生磷酸化修饰，通过蛋白质质谱以及构建PHD2点突变的实验方法明确发生修饰的位点就是第125位的丝氨酸。此外，我们自制特异性识别PHD2 S125位点的磷酸化抗体，并WB双向验证抗体的特异性和PHD2的修饰位点。由于PHD2的磷酸化修饰主要是在G2/M期阻滞时增强，通过细胞周期同步化实验我们发现PHD2磷酸化修饰与Cyclin B1有显著的同步性。我们在细胞内过表达CDK1、Cyclin B1以及PHD2，免疫共沉淀发现三个蛋白有非常强的相互作用。鉴于此，我们通过过表达和敲低内源CDK1以及体外实验证实CDK1就是磷酸化PHD2丝氨酸125位点的上游激酶。由于PHD2的主要靶蛋白是HIF-1α，因此接下来我们详细探究PHD2磷酸化修饰对HIF-1α及其下游基因以及肿瘤的发展是否具有调节作用。我们采用Crisper-Cas9技术构建S125A基因敲入(KI: Knock In)细胞系，通过WB我们发现KI细胞系的HIF-1α蛋白水平显著高于野生型细胞系(WT)，并且KI细胞系的HIF-1α的蛋白基本不受taxol调节。同时，相较于WT细胞系，KI细胞系中糖酵解水平以及HIF-1α下游基因VEGF和GLUT1的表达显著增强。查找TCGA大数据库我们发现PHD2主要在前列腺癌中显著高表达，同时我们在PC-3、DV145和22RV1中敲低PHD2极大的抑制了肿瘤细胞增殖，其中以22RV1细胞系最为依赖PHD2。分析22RV1的细胞周期发现敲低PHD2后细胞周期被明显阻滞在G2/M期。在敲低PHD2的细胞中分别回补野生型和S125A突变体，通过裸鼠移植瘤实验证明只有野生型的PHD2能够恢复22RV1的生长以及肿瘤发展。综上结果说明，CDK1在G2/M期磷酸化PHD2丝氨酸125位点是周期循环所必须的，在周期运转过程中通过周期蛋白激酶活性的动态变化协同调控PHD2的磷酸化水平进而影响HIF-1α及其下游基因的表达，对肿瘤发展具有重要的调节作用。