血流动力学通过AMPK/Nucleolin途径调节内皮细胞功能的机制研究

The atheroprotective flow maintains the homeostasis of endothelial cells in the vasculature. We have previously found that atheroprotective flow causes AMPK phosphorylation of Nucleolin at Ser-328. Given the multifaceted role of Nucleolin in regulating transcription and RNA biogenesis, we propose to study the role of atheroprotective flow activation of the AMPK-Nucleolin axis in regulating endothelium in vitro and in vivo. We will use multi-level approaches including epigenetics, transcriptional genomics, and systems biology to investigate the mechanotransduction and transcriptional regulatory network involved in the AMPK-Nucleolin axis in endothelial cells responding to the atheroprotective flow. To explore the functional consequence of the flow regulation of AMPK-Nucleolin in endothelial function in vivo, we will use CRISPR/Cas9 technology to create mice harboring Nucleolin S328D (phosphomimetic) or S328A (dephosphomimetic) mutant. These mice will be crossed with ApoE-null strain for the investigation of atherosclerosis. With these approaches at the systems level, this research project will decipher the role of atheroprotective flow in maintaining a functional endothelium via regulating the AMPK-Nucleolin axis.

层流剪应力在维持血管内皮稳态中发挥重要作用。我们前期研究发现层流状态下内皮中的AMPK可使Nucleolin S328磷酸化，而已知Nucleolin在调节转录及RNA生成方面具有重要的生理意义，因此我们推测层流剪应力激活AMPK/Nucleolin是维持内皮细胞稳态的关键分子事件。本项目拟采用表观遗传学、转录组学及系统生物学等手段探讨层流剪应力-AMPK-Nucleolin影响内皮细胞功能的分子机制，采用CRISPR/Cas9技术实现Nucleolin S328D（激活型）、S328A（失活型）在体基因定点突变，揭示Nucleolin S328磷酸化对内皮的保护作用及对动脉粥样硬化形成的影响，探讨Nucleolin磷酸化作为动脉粥样硬化干预靶点的可能性。本项目将进一步阐明血流剪应力影响内皮细胞功能的核心作用，并在此基础上明确AMPK-Nucleolin动态网络在血管生物学中的转化意义。

层流剪切力（PS）和湍流剪切力（OS）分别引起不同的机械传导，以维持内皮稳态或引起内皮功能障碍。PS或OS对血管内皮细胞（EC）中的microRNA（miR）进行差异调节。然而，miR的加工调控及其在剪切力作用下对EC生物学的影响尚不清楚。我们对调节miR加工的RNA结合蛋白进行系统分析，发现Nucleolin（NCL）是影响OS调节miR加工的主要调节剂。NCL对于miR-93和miR-484的成熟至关重要，miR-93和miR-484从而靶向调节Krüppel样因子2（KLF2）和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的mRNA编码。另外，anti-miR-93 / anti-miR-484可以在OS下逆转ECs中的KLF2和eNOS mRNA以及NO的生物利用度的降低。我们进一步分析NCL的翻译后修饰，发现PS介导AMP调节蛋白激酶（AMPK）对NCL S328（丝氨酸328）的磷酸化。AMPK磷酸化NCL导致其保持在细胞核中，从而抑制miR-93和miR-484的加工和KLF2和eNOS mRNA的转录。另外，我们在两个队列中发现患有冠状动脉疾病（CAD）病人的血清中miR-93和miR-484的水平升高。该发现表明了AMPK-NCL-miR-93 / miR-484轴在健康和CAD EC中的生物学意义。