microRNAs介导无创肢体缺血预适应心肌细胞保护的机制研究

在前期已建立大鼠无创肢体缺血预适应(NLIP)模型，并证实其延迟相心脏保护作用强度与心脏原位缺血预适应相当的基础上，本项目拟利用芯片检测技术构建经历NLIP及缺血再灌注损伤的大鼠心脏微小RNAs(miR)表达图谱，筛选差异表达miR，展示NLIP诱导的心脏miR表达变化。对有意义的差异表达miR，通过构建其重组质粒及其预测靶基因的荧光蛋白报告基因质粒，转染H9c2心肌细胞，再行缺氧/复氧(H/R)实验，观察目的miR高表达或封闭其表达对H/R损伤和预测靶基因表达的影响，以检测miR是否在NLIP心肌细胞保护中发挥关键性调节作用及其靶基因，从全新角度阐释NLIP的心肌细胞保护作用机制，丰富和发展NLIP延迟心脏保护作用机制的理论内容，为缺血性心脏病的防治提供可能的作用靶点，为NLIP的临床应用提供理论依据。

背景及目的：无创肢体缺血预适应(limb ischemic preconditioning, LIPC) 是目前最具临床应用潜力的内源性心脏保护策略。微小RNAs(microRNAs, miR)是心血管疾病的重要调节因子，其是否在LIPC的心脏保护中发挥关键性调节作用，尚未见文献报道。本研究的目的是检验心脏miR在LIPC时的变化及其在LIPC心肌细胞保护中是否发挥关键性调节作用。.材料与方法：应用miR芯片检测技术，描绘LIPC诱导的大鼠心脏miR表达图谱变化，qRT-PCR对部分差异表达的miR进行验证；构建miR重组慢病毒，感染H9c2心肌细胞，检测LIPC诱导的差异表达miR在H9c2心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)损伤中的作用；双萤光素酶报告基因检测系统检测miR靶基因；构建miR靶基因过表达重组慢病毒，感染H9c2心肌细胞，检测差异表达miR的靶基因在H9c2细胞H/R损伤中的作用。.结果：（1）将经历LIPC和缺血/再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）的大鼠心肌组织总RNA进行芯片检测，经组间两两比较，共发现30个差异表达的miR。经qRT-PCR验证，miR-139-5p等3个miR均呈现在I/R组表达增加、在LIPC组表达减少的趋势。选择优先对miR-139-5p进行功能研究。（2）将miR-139-5p inhibition重组慢病毒感染H9c2细胞，建立miR-139-5p下调的H9c2稳定转染细胞系，行H/R损伤实验。与阴性对照组比较，miR-139-5p下调组对H/R损伤的耐受性增强，表现为细胞生存率增加(P<0.01)，乳酸脱氢酶漏出减少(P<0.01)，细胞凋亡减轻。（3）双萤光素酶报告基因检测系统检测表明，CIAPIN1为miR-139-5p的靶基因。（4）将CIAPIN1过表达重组慢病毒感染H9c2细胞，建立CIAPIN1过表达的H9c2稳定转染细胞系，行H/R损伤实验。与阴性对照组比较，CIAPIN1过表达组细胞存活率有增加趋势。.结论：LIPC引起大鼠心肌组织miR表达谱发生改变，其心脏保护作用可能是通过减少miR-139-5p的表达，进而增加CIAPIN1的表达实现的。本研究为缺血性心脏病的防治提供了新的可能的作用靶点，为NLIP的临床应用提供理论依据