EHD1调控ABCC3转运介导非小细胞肺癌顺铂耐药的机制

Cisplatin-resistance is the bottleneck of chemotherapy in NSCLC. In our previous study, the correlation between higher level of EHD1 expression and cisplatin-resistance in NSCLC patients with chemotherapy（National Natural Science Fund 81172214H1615），but the specific mechanism has not been elucidated. By gene chip screening for A549/DDP cells and A549/DDP/EHD1- cells we found lots of relative genes regulated by EHD1, of which ABCC3 we have proved in previous study（Sci Rep. 2013 ） is expressed higher in cisplatin-resistant A549/DDP cell lines, and the expression of ABCC3 was correlated with EHD1 positively. It was reported that EHD1 is a protein regulating membrane protein trafficking. We postulated that EHD1 may be involved in cisplatin-resistance by regulating the trafficking of ABCC3 or interacting with ABCC3. Therefore, we are planning to elucidate the mechanism how EHD1 regulates cisplatin-resistance by starting with cell lines, xenograft models and cancer tissues from NSCLC patients by using gene transfection and siRNA . By means of immunofluorescence, IP, GST pull-down, we are aiming to explore how EHD1 involved in developing cisplatin-resistance through modulating ABCC3 trafficking and its downstream signaling pathway. This study may provide novel molecular target and new thought from the new perspective of endocytosis modulation in overcoming cisplatin-resistance in NSCLC.

顺铂耐药是制约非小细胞肺癌（NSCLC）化疗疗效的主要难题。我们前期研究发现NSCLC患者EHD1高表达与顺铂耐药密切相关（国自然81172214H1615），但机制尚未阐明；课题组进一步通过基因芯片筛选出一系列受EHD1调节的相关基因，其中课题组既往研究证实的顺铂耐药相关基因ABCC3（Sci Rep. 2013 ）在肺癌耐药细胞系A549/DDP中高表达，并且在NSCLC肺癌组织中表达与EHD1表达正相关。已有文献报道EHD1是调控细胞膜蛋白内吞转运的转运调控蛋白，我们推测EHD1可能通过调控ABCC3内吞转运或者与之相互作用参与NSCLC顺铂耐药。本项目拟通过干预EHD1表达，采用免疫荧光、IP等方法探讨EHD1对ABCC3内吞转运和下游信号传导通路的调控进而引起顺铂耐药的分子机制。本项目将从调控内吞转运的新视角为临床逆转NSCLC患者顺铂耐药提供新靶点和新思路。

项目背景：新的靶向药物的发现以及耐药机制的探索对于癌症头号杀手肺癌的攻克至关重要。本课题组一直致力于研究肺癌耐药的机制，探索新的肺癌治疗靶点及其临床转化。主要研究内容：首先，EHD1 调节β2AR信号通路能够促进非小细胞肺癌血管形成（已发表）；其次IL-1β/EHD1/TUBB3轴参与EGFR-TKI的抵抗（已发表）；最后EHD1调节相关基因14-3-3家族一员之14-3-3ζ能够独立调节非小细胞肺癌吉非替尼耐药（待发表）。首先从TCGA数据库中14-3-3ζ在mRNA水平的表达以及与预后的关系；用蛋白印迹法检测肺癌组织和正常组织中14-3-3ζ表达差异以及其在不同肺癌细胞系中表达的情况；沉默14-3-3ζ观察细胞在侵袭运动和划痕试验中的细胞运动变化情况及调亡情况；基因芯片筛选沉默14-3-3ζ表达的耐药细胞与对照组耐药细胞耐药相关基因；蛋白印迹法进一步验证相关基因的下游信号通路蛋白表达情况；体内裸鼠成瘤试验证实沉默14-3-3ζ对于耐药性影响；最后在EGFR突变非小细胞肺癌吉非替尼治疗患者中验证14-3-3ζ与耐药性的关系。重要结果：14-3-3ζ在肺癌组织中与预后差相关；在肺腺癌组织标本中发现14-3-3ζ表达高于周围正常组织；14-3-3ζ在肺癌EGFR野生型细胞系中表达较低，在肺腺癌EGFR突变耐药细胞系中表达增高；14-3-3ζ敲降显著抑制肺腺癌细胞的运动，迁移和侵袭；14-3-3ζ的敲降对肺腺癌细胞凋亡产生影响；沉默14-3-3ζ的H1975耐药细胞种植于裸鼠成瘤试验提示抑制14-3-3ζ后能够逆转H1975吉非替尼的耐药性；选取H1975原发耐药细胞，与沉默14-3-3ζ后的H1975细胞差异蛋白中筛选出相关基因调节后，我们推测14-3-3ζ在EGFR突变非小细胞肺癌吉非替尼耐药细胞中通过调节BMP2/BMPR2/SMAD5/ID1参与耐药；进一步的信号表达试验验证了14-3-3ζ通过BMP2/BMPR2/SMAD5/ID1信号通路的激活，使细胞增殖能力增强，削弱了靶向药物的杀伤能力。科学意义：本研究首次发现14-3-3ζ在肺癌吉非替尼耐药细胞中表达增高，与肺腺癌预后不佳相关，并创新发现14-3-3ζ通过调节BMP2/BMPR2/SMAD5/ID1信号通路调节吉非替尼耐药；为新的靶向药物的发现提供了思路，并为转化研究提供了靶点。