菠菜硝酸盐积累关键生理过程的分子机理研究

Excessive accumulation of nitrate can not only be harmful for human beings, but also limits improvement of nitrogen use efficiency. Thus it is needed to reduce nitrate accumulation in spinach. Many researches have been conducted on the plant nitrate accumulation, but little is know about the mechanism of plant nitrate accumulation, especially in molecular level. In this project, we will compare the physiological and molecular characteristics of nitrate uptake, translocation, assimilation and storage/reutilization between 8 spinach genotypes with high or low nitrate accumulated (also different with nitrogen use efficiency and nitrate distribution). Molecular cloning and functional analysis of key genes involved in spinach nitrate accumulation will also be done for revealing nitrate accumulation mechanism in spinach.

菠菜大量积累硝酸盐会危害人体健康并限制氮素利用效率的提高。为深入揭示菠菜硝酸盐积累规律，从源头控制菠菜硝酸盐的积累，本项目在前期大规模菠菜种质资源筛选的基础上，获得的8份菠菜高、低硝酸盐积累代表性材料为研究对象，通过比较其硝态氮吸收、运转、同化、贮存过程相关生理指标和基因表达的时空动态变化差异，明确菠菜硝酸盐积累差异的主要原因，筛选和克隆菠菜硝酸盐积累关键基因，揭示菠菜硝酸盐含量差异的生理分子机制。本项目的实施对提高菠菜硝酸盐积累规律的认识和后期的关键基因功能鉴定及低硝酸盐菠菜分子育种具有重要的理论意义和实用价值。

为揭示菠菜硝酸盐积累的分子机制，本项目在分析菠菜硝酸盐积累的关键生理过程基础上，鉴定和筛选了菠菜硝酸盐积累关键基因，克隆了2个菠菜硝酸盐转运蛋白编码基因，并通过转化拟南芥研究其可能的生物学功能。主要结果如下：.1.菠菜种质材料间硝酸盐含量差异较大（0.21-3.83 mg/gFW）。硝酸盐含量与维生素C、胡萝卜素之间存在较弱的负相关。皱叶菠菜硝酸盐含量明显高于平滑叶片。选择其中硝酸盐含量差异的4个菠菜材料（S10、S13、S18、S57），设置高（15 mmol/L）、低（0.5 mmol/L）硝态氮浓度处理，发现高硝酸盐积累型菠菜材料S13的15NO3--N吸收速率在两个浓度水平下均显著高于其它基因型，而其氮素生理利用效率（NutE）、氮素利用效率指数（NUR）显著低于中等硝酸盐积累型材料（S18和S57）；S18和S57地上部分干重（SDW）、硝酸还原酶活性（NRA）、NutE、NUR显著高于S13和低硝酸盐积累型S10，而15NO3--N吸收速率低于S13；S10的SDW、NRA、NutE及NUR显著低于S18和S57，15NO3--N吸收速率及氮素吸收效率显著低于S13号。以上说明特定材料间硝酸盐含量差异的主要生理原因不同；.2.以吸收和同化为主要差异原因的S10和S18为研究对象，发现低硝态氮条件下，根硝酸盐含量与SoNRT1.2和SoNRT1.8转录水平正相关；叶柄硝酸盐含量与SoNRT1.4及SoNRT1.5转录水平在高硝态氮处理下显著正相关，而与SoNRT1.3转录水平负相关。未发现硝态氮同化相关基因表达与硝酸盐含量之间的明显相关性。液胞质子泵编码基因VAB、VPH在高氮处理的叶柄中表达量急剧上调，可能在硝态氮液泡贮藏过程中发挥重要作用；.3.克隆了两个硝酸盐积累关键NRT（SoNRT1.3和SoNRT1.5）基因，生物信息学分析表明两者均编码跨膜蛋白，具有MFS家族保守结构PTR2，且主要在根中受硝态氮诱导。亚细胞结果显示两者定位于细胞膜上。将SoNRT1.3和SoNRT1.5分别转化拟南芥，发现过表达SoNRT1.3显著降低了高硝态氮浓度下转基因拟南芥地上部分硝酸盐含量，过表达SoNRT1.5提高了低硝态氮浓度下拟南芥地上部分干重。SoNRT1.3和SoNRT1.5编码蛋白可能通过影响体内硝态氮的再分配影响硝态氮的分布及利用。