一株人工诱导的羊种粗糙型布鲁氏菌RM57表型改变机制探究

Brucellosis is an important zoonosis caused by Bucella spp.. According to the phenotypic differences, Brucella strains can be divided into smooth and rough type. It is generally belived that the integrity of lipopolysaccharide (LPS) determines Brucella phenotype. In our laboratory, the rough anti-sera induced method was successfully taken to screen out the rough type mutants Brucella RM57 strains from the smooth type Brucella melitensis strains M1981, and the classical LPS synthesis-related genes in RM57 were not changed by PCR detection.. In order to find the key factors for RM57 phenotypic changes, Illumina and PacBio sequencing technology will be used to sequence the whole genome of smooth parent strain M1981 and rough type mutants RM57, and bioinformatics will be used to predict the gene candidates involved in RM57 phenotype changes. Additionally, gene knockout and insertion technique will be utilized to verify the function of target genes. This study is expected to find new genes involved in LPS biosynthesis of Brucella and clarify the related virulence mechanism of Brucella.

布鲁氏菌是一种重要的人畜共患病原菌，根据其表型差异可分为光滑型和粗糙型2 种，一般认为布鲁氏菌脂多糖（LPS）的完整性决定了其表型。本实验室以光滑型羊种布鲁氏菌分离株M1981为亲本，采用粗糙型抗血清诱导的方法，筛选获得了一株粗糙型布鲁氏菌RM57株，PCR验证结果表明RM57中与经典LPS合成途径相关的系列基因均未发生改变。为了进一步确认RM57表型改变的关键因素，本项目将使用Illumina和PacBio测序技术对亲本光滑型M1981和诱变粗糙型RM57株进行全基因组测序，之后通过生物信息学分析与RM57表型改变的可能基因，并采用基因敲除和基因插入技术对预测的靶基因进行功能验证。本研究有望寻找到与布鲁氏菌LPS合成途径相关的新基因，丰富布鲁氏菌毒力致弱机制。

布鲁氏菌是一种重要的人畜共患病原菌，根据其表型差异可分为光滑型和粗糙型2种，一般认为布鲁氏菌脂多糖（LPS）的完整性决定了其表型。本实验室早期通过粗糙型血清诱导而获得了一株粗糙型布鲁氏菌突变株RM57。在本研究中通过多种实验技术以期揭示该粗糙型突变株表型改变的分子机制。. 通过对细菌脂多糖的完整性进行检测，发现RM57突变株的脂多糖明显发生改变。进一步对RM57突变株在细胞感染模型和小鼠感染模型中的毒力进行测定，结果表明RM57突变株在细胞感染模型和小鼠感染模型中毒力均显著降低。对已知与脂多糖合成相关基因的表达水平进行测定，结果这些基因的表达水平均无显著性差异。. 采用Illumina Hiseq测序和单分子PacBio测序相结合的方式测定了亲本菌株M1981和突变株RM57的全基因组序列，并将测定的基因组序列提交至GeneBank数据库。通过比较基因组学分析发现RM57突变株中的10个开放阅读框发生了突变，其中M1364、M1746、M2611三个基因发生SNP突变，M0025、M0230、M1745、M0161、M0495和M0497六个基因发生移框突变，M1681发生大片段缺失。对发生移框突变和大片段缺失的七个基因分别构建了缺失株，但这些缺失株均为光滑型表型且在细胞和小鼠感染模型中毒力均不降低。. 为了进一步从转录水平探索RM57突变株表型改变的分子机制，测定了RM57和M1981的转录组，结果显示和亲本菌株M1981相比，RM57突变株在转录水平上共有1205个基因表达水平显著改变，其中597个表达水平显著上调，608个基因表达水平显著下调。对差异表达基因的COG聚类分析表明，这些基因主要集中于“energy production and conversion and translation”和“ribosomal structure and biogenesis”两个聚类。KEGG数据库的富集分析结果表明，显著差异表达的基因主要富集于“oxidative phosphorylation”、“ribosome, nitrogen metabolism”、“tyrosine metabolism”以及“two-component system”四条通路中。. 本项目的研究结果为研究布鲁氏菌脂多糖合成的分子机制和布鲁氏菌致病机制都具有一定的指导意义。