新型单宁酶Tan410结构与多底物催化功能关系研究

Tannase is a kind of hydrolytic enzymes which can hydrolyze gallic tannin in plant. In our earlier research, a novel tannase (Tan410) isolated from a soil metagenomic library can not only hydrolyze gallic tannin, but also hydrolyze ferulic acid esters, caffeic acid esters and ρ-nitrobenzoic acid esters. This discovery overturns the argument that tannase only hydrolyze gallic esters compounds. In order to find out its catalysis reaction mechanism, in this project, the crystals of Tan410 and protein-substrate complex which was obtained by using hanging drop vapor diffusion and soaking method, respectively, after Tan410 purified though methods of affinity chromatography, molecular sieve chromatography and anion exchange chromatography, were analyzed by X - ray diffraction crystallography method. The point of saturation mutagenesis technology was used to confirm active-site and substrate binding sites of Tan410 to find out its structural and functional relationship. Consequently, the expected results of this project may not only significantly contribute to the valuable information on tannase catalytic mechanism and its structural and functional relationship, but also provide scientific basis on tannase new function development and modification.

单宁酶是一种能水解没食子酸单宁的酯键生成没食子酸和其它化合物的酶，而新型单宁酶Tan410不仅可以水解没食子酸单宁，还可以水解阿魏酸酯类、咖啡酸酯类及对硝基苯酚酯类化合物，这打破了单宁酶只能水解没食子酸酯类化合物的论点。为明确Tan410的结构与多底物催化功能间的关系，本研究拟以筛选到的Tan410为研究对象，通过亲和层析、分子筛层析及离子交换层析等技术获取高纯度Tan410；利用悬滴气象扩散和晶体-底物浸泡法分别制备Tan410及酶-底物复合物晶体；通过X-ray衍射晶体学方法解析Tan410及酶-底物复合物的晶体结构，揭示其催化反应机理；结合点饱和突变技术来确定Tan410的催化活性中心和底物结合位点，研究Tan410结构与催化功能间的关系。研究结果不仅有助于阐明单宁酶的分子催化机理，明确单宁酶结构与多底物催化功能间的关系，还为发掘单宁酶的新功能，指导酶分子设计及改造提供重要科学依据。

单宁酶（EC3.1.1.30）又称单宁酰基水解酶（Tannin Acyl Hydrolase），能水解单宁酸中的酯键和缩酚酸键，生成没食子酸和其它化合物, 在茶饮料、酒类、果汁等行业中都有广泛的应用价值。前期研究工作中，我们从土壤环境中筛选到了1个新型单宁酶Tan410。其底物催化特性研究发现，与现有的单宁酶相比，Tan410具有更广泛的底物水解范围，不仅可以水解没食子酸酯类化合物，还可以苯甲酸酯、羟基苯甲酸酯、香草酸酯、二羟基苯甲酸酯、阿魏酸酯、咖啡酸酯、对香豆酸酯、芥子酸酯和绿原酸；此外，酯酶的水解底物范围研究显示，Tan410具备宽广的酯酶底物水解范围，说明Tan410不仅具有单宁酶的性质，还同时具备酯酶、阿魏酸酯酶和绿原酸酯酶的性质。为了解Tan410的三维结构，我们制备了可以进行x-ray衍射的Tan410晶体，其分辨率为0.979 Å。结构解析发现Tan410含有一个α/β水解酶催化结构域和一个“帽子”结构，催化结构域由8个β-sheet和6个α-helix组成一个 αβα “三明治”结构；“帽子”结构由4个α-helix构成位于催化结构域的上方，二硫键（Cys27–Cys75, Cys190–Cys508, Cys258–Cys486 和 Cys275–Cys435）的出现使得Tan410分子结构更加稳固。Ser191, Asp399和 His434组成了Tan410催化结构域，Leu233，Phe334，Tyr302 和Leu401等位点作为底物的结合位点，为Tan410的催化功能起了重要的作用。Tan410结构的解析，为Tan410的分子改造提供了科学依据，进而为Tan410在茶饮料及红酒酿造等工业应用奠定了基础。