交联质谱法寻找新型毒素的作用靶点

Animal venom is a treasured library for biological drug discovery. Venom drug is favored over chemical drug because of the advantages of high specificity, no addiction and no resistance. However, venom drug pharmacy is difficult, and the main bottleneck lies on venom target identification. The majority of the venoms, more than 95% of the total identified ones, we have no idea of what proteins they can specifically interact with. Transitionally, animal models and electrophysiological approaches are applied to identify target proteins of venoms, however, this strategy can only be limited to match venoms and the targets that we have already known. In this project, we would setup a novel approach that coupled chemical crossing-link and mass spectrometry to identify novel venom targets, especially the targets of conotoxins. Toxin sequence is first interacted with cross-linker, and then incubated with C. elegan embryonic cell suspension. After the toxin is specifically located to its interacting partners, the cross-linker is activated to covalent linked to the venom target proteins. Toxin-Linker-Target complexes are purified and submitted to mass spectrometry analysis. The candidate target proteins are identified and the direct interaction of venom and target is confirmed by activity assay. This target identification strategy coupled with chemical cross-linking and mass spectrometry can identify all possible venom targets unbiasedly, not only increases the successful rate in target mining, but also helps to predict possible side-effects during clinical application, therefore, can further improve the success rate of toxin drug in the pharmaceutical clinical trial.

动物毒素是生物制药研发宝库。比起化学药物，毒素类药物因作用靶点特异性好和不上瘾不产生抗药性等优点而备受青睐。但毒素制药困难重重，其主要瓶颈在于毒素的靶点鉴定，大多数毒素（>95%）我们只知其序列而不知其靶点。传统研究采用动物模型和电生理实验来鉴定毒素的作用靶点，该方法只能针对已知的靶点进行筛选，具有很大的局限性。在本项目中，我们将建立一个结合化学交联和质谱技术来鉴定毒素，主要是芋螺毒素，作用靶点的新方法。毒素多肽与交联剂共价连接后，与线虫胚胎单细胞孵育，当毒素与细胞膜上的靶点特异性结合后，诱导交联剂与靶点进行交联。毒素-交联剂-靶点复合物经分离纯化后用质谱技术进行靶点鉴定，并验证靶点生理活性。这个交联质谱法可以全面无差别地筛选所有与毒素特异性结合的靶点，不仅可以极大地提高靶点鉴定的成功率，还有助于预测毒素在临床应用过程中可能出现的副作用，进一步提高毒素制药进入临床实验后的的成功率。

过去十多年间，来源于动植物毒素的多肽由于具有作用靶点特异性好和不上瘾不产生抗药性等优点而受到新药研发相关科研工作者的青睐。虽然在自然界中，天然毒素的多肽序列估计有数百万之多，但目前已成药的却不足双手之数。究其原因主要有二：一是临床研究后发现活性不高，或副作用太强等导致失败，成功率大概在10%左右；二是在基础研究时，毒素序列被鉴定后，在其功能及作用靶点的研究上进展艰难，目前成功率不足5%。 本项目致力于解决第二个困难，试图通过结合质谱技术和交联技术来为毒素的作用靶点研究另辟蹊径。. 本项目筛选毒素作用靶点的主要流程为，首先让毒素与细胞膜上的可能靶点充分反应，然后采用化学交联的方法，将空间上相互接近的毒素与靶点交联，靶点经由化学交联剂上的特殊标签（biotin）富集并分离纯化，最后用质谱技术来鉴定并筛选毒素的直接作用靶点候选蛋白。项目共合成了四条不同的序列，包括已知靶点的ImI，未知靶点的conomarphin（分别含有苯丙氨酸L型和D型两种构象），qc16a和ts14a。靶点来源筛选了三种不同的神经细胞，分别为秀丽线虫胚胎细胞，小鼠海马神经元细胞系HT22， 和大鼠类交感神经细胞系PC12。. 与阴性平行实验对照后的western blot结果显示，只有在毒素序列ImI与线虫胚胎细胞或HT22细胞的交联样本，conomarphin-L与线虫胚胎细胞的交联样本，以及conomarphin-D与HT22细胞的交联样本中检测到了特异性的带有biotin标签的条带，其他的毒素与细胞组合样本结果皆为阴性。但这几个有阳性western blot结果的样本，用streptavidin磁珠富集后进行质谱鉴定，始终未能如愿鉴定到靶点蛋白，包括ImI的已知靶点nAChR。后续的实验证实，毒素-交联剂-靶点蛋白复合物中的biotin标签并不能成功结合到磁珠的streptavidin上，我们推测复合物在空间上阻碍了biotin与streptavidin的结合。同理推之，western blot的阴性结果也有可能是由于交联剂对毒素与靶点的结合造成了空间上的阻碍造成的。. 综上所述，由于空间位阻的原因，本项目所研究的交联质谱法对于毒素作用靶点的鉴定结果不容乐观，但也不排除仍有一定的应用前景。