程序化多功能siRNA基因载体设计及作用机理研究

siRNA基因是一类新型的治疗基因，其传递入胞并发挥功效是一个复杂的多步骤生物过程，高效载体的设计更是目前的研究热点。已有的非病毒载基因系统中阳离子聚合物和阳离子脂质体在siRNA传递的各步中各具优势，但仍不甚理想。本项目设计合成一类新型脂质聚合物，合理整合载体中各项功能，程序化的在siRNA传递过程中发挥作用。聚合物在胞外，以高密度的正电荷装配基因，亲水性PEG链屏蔽非特异性作用，靶向基团特异性识别诱导入胞，之后能程序化的去PEG，将脂质融合和质子泵等溶酶体破坏性能恢复，从而顺利释放基因发挥作用。载体设计考虑到从体外载体装配、靶细胞识别、细胞吸附、内吞、载体分离、内吞体逃逸各个步骤，通过载体结构对比和荧光探针标记，更直观全面的评价载体在各步中对siRNA传递的影响。通过筛选可得到稳定/高效/低毒的新型载体，为基因载体的设计提供有力的生物学研究基础。

将治疗性的基因传递入胞并发挥功效是一个复杂的多步骤生物过程，高效的载体设计是保证其有效发挥功能的重点。由于传递过程中的微环境不同，载体需要在不同时间和位置发挥不同的作用。为此，本项目设计合成了具有“程序化”去屏蔽特性、靶向性的多功能聚合物，对其安全性、体外转染情况和体内作用效果进行评价。执行过程顺利，按照原有计划构建了pH敏感的脂质聚合物，在亲脂性的胆固醇与亲水性的PEG键引入腙键，并在屏蔽层上连接上靶向基团。此外，我们还构建了另一种高分子的阳离子聚合物，载体的屏蔽层设计引入还原敏感的二硫键。我们对两种环境敏感系统的合成进行了优化，考察了敏感键的比例、PEG的密度等对环境响应速度和程度上的影响和规律；研究靶向基团浓度、密度对细胞识别的效能探究其进入细胞后的变化，探究不同系统对入胞过程、吞噬原理、胞内位置及转染效果的相互关系；基于体外研究的成果，将优化的系统应用到动物体内，考察分析体内外结果的关联性、靶向效率及体内分布，以期得到稳定、高效、低毒的新型载体，为基因载体的设计提供有力的生物学研究基础。随后，在“去屏蔽”化设计的复合载体成功的基础上，我们又赋予了复合物核内阳离子聚合物（PEI）环境敏感的特性，希望核内复合物（PEI/DNA）能在循环时稳定存在，在进入细胞后解离，有效释放DNA。.通过我们的研究，已经得到三类“程序化”设计的环境响应型基因传递载体，对肿瘤细胞具有特异的识别性，其体外转染效果较传统载体分别高出40、14和5倍，体内效果提高一个数量级。经过对入胞过程和原理的研究，我们确定此类“程序化”的载体模拟了天然病毒的转染步骤，其化学和物理特性随微环境不同而发生变化，引起特定的生物学效应。.项目通过三年的实施，圆满完成了研究计划，达到了预期目标，取得了一系列研究成果。共发表SCI源刊论文7篇（包括材料方面权威杂志Advanced Materials 1篇，生物材料方向的权威杂志biomaterials 3篇，journal of controlled release 1篇）；申请发明专利5项，1项获得授权；培养了3名博士研究生2名硕士研究生。基于该项目的研究基础和成果，项目负责人在执行期间又获得了1项国家自然基金面上项目和1项四川大学优秀青年学者科研基金，获得2010、2012和2013年“四川大学青骨干教师”荣誉称号；以第一主研参与了1项中德中心（国家自然基