三个新基因在玉米籽粒植酸代谢途径中的功能鉴定

About 75% of seed total phosphorus is found in phytic acid. Phytic acid and its metabolits are involved in a number of metabolic, developmental and signaling pathways with essential biological function. However, biosynthesis of phytic acid is poorly understood in plant because of some ‘missing links’ in the pathway..In previous study, we employed an association population consisted of 527 maize inbred lines for genome wide association study (GWAS) using phytic acid and inositol phosphate content as phenotype data, and obtained three candidate genes. And all the Arabidopsis mutants of three genes showed reduced phytic acid content compared with wild type. Therefore, the three genes were supposed to involve in phytic acid metabolism pathway. In this case, the functions of three genes will be identified and characterized via genetic complementation assay of Arabidopsis mutants, expression pattern, tissue and cellular localization, overexpression and RNAi transgenic plant, analysis of protein interaction and other molecular evidence. This study will provide new information for better understanding of phytic acid metabolism pathway. Meanwhile, novel functional genes discovered in this research could be used for improvement of maize quality.

禾本科和油料作物种子中总磷的75%以植酸形式存在。植酸及其代谢中间产物在植物体内参与种子休眠、维持细胞内磷平衡及信号转导等多种生命活动，具有重要生物学功能。但是，植酸在植物体尤其是种子中的代谢过程依然存在很多“断点”，未得到完整的阐释。.在前期研究中，以植酸及其代谢物磷酸肌醇为表型数据，通过对527份玉米自交系构成的关联群体进行全基因组关联分析，筛选出3个功能未知的基因。三个基因的T-DNA插入突变体种子中植酸含量均下降约70%。推测候选基因与植酸代谢途径的调节密切相关。本项目拟以上述基因为研究对象，通过拟南芥突变体互补实验，候选基因的表达模式、组织及细胞定位、应用过表达和RNAi转基因研究及互作蛋白的筛选分析其在玉米籽粒中的生理功能，不仅可以探明植酸在玉米籽粒中的代谢途径，为调控玉米籽粒植酸代谢的研究提供重要信息，而且可获得具有自主知识产权的功能基因，为改良玉米品质提供重要的基因资源。

在前期研究中，以植酸及其代谢物磷酸肌醇为表型数据，通过对527份玉米自交系构成的关联群体进行全基因组关联分析，筛选出3个功能未知的基因。.lpar1, ZmLPA-like1，经生物信息学分析是作用于肌醇磷酸代谢途径的激酶，其保守结构域是P-Loop环。RNAi的转基因种子植酸水平显著下降，无机磷水平显著升高；相反，过表达的转基因种子中无机磷水平显著下降，植酸水平显著升高。LC-MS/MS测定显示RNAi的转基因种子中，InsP3, InsP4, InsP5 和InsP6的含量都有所下降，InsP1的含量上升。MST的底物结合实验显示除Ins（1,2,3,4,6）P5外，其余十几种底物都有不同程度结合。用ADP GloTM试剂盒证实，lpar1在Ins(1,2,5,6)P4 ,Ins(1,4,5,6)P4, Ins(4,5)P2, Ins(1,4)P2和 Ins(1,3,4)P3存在下有激酶活性。.根据RT-PCR结果显示，lpar2和lpar3这两个基因在胚中的表达水平均比胚乳中高。lpar2和lpar3的GFP融合蛋白的亚细胞定位实验显示两个基因均定位于胞质、细胞核和细胞膜中。lpar2和lpar3基因获得了过表达转基因种子，现与Qi319和B73两个自交系进行回交转育，初步测定发现，两个基因的过表达转基因种子中的植酸含量均有所升高，磷含量降低，这些基因可以促进肌醇磷酸合成。.本项目鉴定了ZmLPA-like1基因的功能，作为一个催化肌醇磷酸合成途径的激酶，找到了其作用的底物。这是第一个解析作用底物的带有P-Loop结构域的酶。