油菜素内酯调控玉米籽粒发育的转录因子鉴定及功能研究

Brassinolide, the first brassinosteroid isolated and shown to have biological activity Brassinosteroids (BRs) are a class of polyhydroxysteroids. It can improve seed development of maize, Howerver, the molecular regulation mechansim is still unclear so far. In field trial, we found that Brassinolide can increase grain length, grain width andhundred-grain weight, and obviously enhance the production. The seeds 10 days after pollination separated maize inbred line Mo17 have been treated with 10nM Brassinolide at 28℃ for in dark for 6 and 12 hours respectively. The differential expression analysis of the RNA-seq data about maize seed transcriptome reveals that 27 grain-development-related genes and 52 transcription factors have been screened. We speculate that the expressions of these grain-development-related genes should be regulated by transcription factors induced by Brassinolide. Based on this The candidate transcription factors induced by Brassinolide involved in seed development would be screened by the co-expression analysis, and will be identified by using the technology of EMSA, Subcellular localization, Yeast one-hybrid library and endosperm transient expression system. And then, the biology function of transcription factor will be researched by transgene maize. The results would reveal the molecular mechanisms of seed development regulated by Brassinolide.

研究表明油菜素内酯激素能促进植物籽粒发育，但分子调控机制仍不清楚。本课题组田间试验表明油菜素内酯能显著增加玉米籽粒长，粒宽和百粒重。因此，利用高通量测序技术，对玉米自交系Mo17授粉后10天的籽粒经油菜素内酯处理后进行转录组测序，测序结果进行差异表达基因筛选并进行转录因子预测，初步筛选到27个差异表达的籽粒发育相关功能基因，52个可能介导油菜素内酯调控籽粒发育的候选转录因子。本项目在此基础上，以这27个差异表达的基因为靶基因，进一步筛选介导油菜素内酯调控籽粒发育相关基因表达的转录因子，通过亚细胞定位，酵母激活，DNA结合实验，凝胶阻滞电泳，胚乳瞬时表达等方法对候选转录因子进行鉴定，对鉴定的转录因子构建植物表达载体，获得转基因植株，对其性状鉴定并通过染色质免疫沉淀技术分析转录因子的DNA结合原件及生物学功能，深入揭示油菜素内酯调控玉米籽粒发育的分子机制。

玉米是三大粮食作物之一，主要用于饲料、工业、食品加工等方面，其产量对于国家粮食安全以及经济的发展具有重要影响。玉米产量是由源与库协调发育的结果，课题组前期研究表明油菜素内酯激素（BR）能够促进植物光合作用以及籽粒发育，但分子机制仍不清楚。本项目利用高通量测序技术，分别对BR处理的玉米叶片以及籽粒进行转录组测序，运用生物信息学进一步对转录组数据中的差异基因进行分析，通过一系列分子生物学手段以及转基因材料表型鉴定，系统揭示BR从源到库调控玉米籽粒发育的分子机制，为分子育种提高产量奠定基础。通过转录组数据差异基因分析，结合前人定位结果筛选得到可能介导BR调控的转录因子ZmWRKY82以及功能基因ZmSLG1。通过玉米胚乳瞬时表达系统、EMSA、以及体外DAP实验分析后，表明ZmWRKY82能够与ZmSLG1基因启动子中WLE-box结合参与到BR内源稳态的调节中，从而调节籽粒发育。同时发现ZmBZR1过表达材料中籽粒增大，淀粉合成相关基因表达上调，胚乳瞬时表达系统以及EMSA实验表明ZmBZR1能够与Bt1和ISA2基因启动子上的关键顺式作用元件结合并调控其表达。通过全基因组分析鉴定ZmGSK基因家族，通过酵母双杂以及BiFC实验结果表明ZmGSK家族中两个亚家族成员能与ZmBZR1相互作用，可能参与到BR调控下游基因的途径中。另外，田间以及实验室结果均表明BR处理叶片后能够提高叶绿素含量，同时酶活检测以及定量分析发现BR能够促进暗反应相关酶活性以及基因的表达。进一步通过对转录组筛选得到多个介导BR调控光合作用相关基因的候选转录因子，其中两个转录因子ZmbHLH157和ZmNFYC1参与调控玉米C4-NADP-ME表达，在酵母中以及胚乳瞬时表达实验均表明这两个转录因子能够与ZmC4基因启动子上关键顺式作用元件结合。