感觉神经元Ca2+激活氯电流的分子基础及Ca2+特异性选择机制

Ca2+-activated Cl- current (CaCC) is an important biological current which is crucial for the epithelial secretion, smooth muscle contraction and sensory processing. Recent studies indicate important role for CaCC in sensory functions. Based on our own and others studies, we propose the following hypothesis: different functional CaCC may exist in subpopulation DRG neurons, with TMEM16A to be the CaCC in small nociceptor DRG neurons and Bestrophin-1 to be the CaCC in medium and large mechano-sensitive and proprioceptive neurons. This application is designed to provide the support for the hypothesis through the following studies: to study whether there exist CaCC with different properties in subpopulation of DRG neurons, the molecular basis of these different CaCC; to study whether TMEM16A and Bestrophin-1 underlie the membrane receptor (intracellular Ca2+ release) activated CaCC and Ca2+ channels ( Ca2+ influx) activated CaCC, respectively; and to study the mechanism for activation of TMEM16A and Bestrophin-1 by different source of Ca2+.

钙激活氯离子通道（Ca2+-activated Chloride Channels， CaCCs)在感觉传导、上皮细胞分泌以及平滑肌细胞收缩等过程中发挥着重要的作用。最近的一系列研究提示CaCC在感觉神经元功能中发挥重要作用。根据我们自己及他人的前期工作我们提出如下假设，背跟神经节（DRG）特定的神经元亚型中可能有不同的CaCC功能表达，即小直径痛感觉神经元中为TMEM16A，中、大直径机械、位置感觉神经元为Bestrophin-1。 本研究将通过如下研究内容验证我们的假设：DRG特定的神经元亚型中是否存在不同类型的CaCC；这些不同类型CaCC的分子基础是什么；TMEM16A和Bestrophin-1是否分别构成膜受体（内Ca2+释放）和膜电压依赖性钙通道（外Ca2+内流）激活的CaCC；导致TMEM16A和Bestrophin-1选择性地被不同途径来源的Ca2+激活的特异性机制是什么

本课题研究的核心内容是了解 DRG神经元钙激活氯通道（CaCC）的分子基础及功能调节机制, 重点了解CaCC与细胞Ca2+之间相互作用的分子机制。项目在基本按原计划执行的基础上进行了拓展，在重点研究以ANO1（TMEM16A）为代表的CaCC与Ca2+相互作用的基础上，对体积调控的氯通道（VRCC）的Ca2+依赖性及激活机制进行了研究。主要完成的研究内容包括：一：DRG痛感觉神经元中CaCC激活的Ca2+的来源特异性；二：氯通道调节剂对两种CaCC- ANO1和Bestrophin1作用特征；三：细胞内Ca2+在激活DRG神经元体积调控氯通道（VRCC）中的作用；四：ANO1在DRG神经节VRCC中的作用。主要的研究结果包括：一，证实在疼痛感觉神经元中， ANO1（TMEM16A)仅与特异性的钙信号有偶联，而对于 整体钙升高是有“隔离”效应的。同时我们发现ANO1存在于神经元细胞质膜与内质网膜（ER）之间连接的信号复合物中。这些复合物也包括细胞质膜上的促炎症反应的G蛋白 偶联受体（缓激肽受体）和ER膜上的IP3受体。这个复合结构可以保证在炎性GPCR信号通 路中ER释放的钙可以激活ANO1，同时，这种结构可以将ANO1与整体钙升高 （例如电压依 赖性钙通道的激活） 信号隔离，由此提出了感觉神经元区别病理性痛与生理性感觉的新机制；二，系统分析比较了7种氯通道调节剂对钙激活氯通道ANO1和Bestrophin1的效能效价及动力学特征，为进一步研究CaCC的激活及调控机制提供有效手段; 三，细胞内Ca2+在DRG神经元及HEK293细胞VRCC激活中发挥关键作用，是VRCC激活的必要条件；四，ANO1是构成DRG及HEK293细胞的重要组成部分。上述研究结果为全面了解CaCC的功能调控分子机制，尤其是了解其Ca2+调节机制提供了新的实验证据；同时为了解CaCC相关的生理功能和病理学意义奠定了基础。