基于肺主肃降理论对二陈汤加味治疗COPD结构重建的机制研究

This study based on the pathogenesis of COPD and pulmonary zhu sujiang theory, In the early stage of the clinical and experimental study is given priority Supplemental Er Chen Decoction was effectivity to COPD,but its mechanism of action is unclear currently.In this study, the rat model with COPD was prepared ,in vitro culture of HBE and AECII，ELISA，radioimmunoassay，Protein imprinting method（to test activityof P-SMAD2，P-SMAD3、P-SMAD7、P-P38MAPK）spectrofluorophotometer（activity of caspase-3、caspase-8）,RT-PCR（TGF-β1、TNF-α、ET-1、PPAR-γ、VEGF、VEGFR2、PERK、eIF2a，IL-8、MCP-1和MIP-2A mRNA），Westem blotting method（Protein of uPA uPAR、PAI-1和PAI-2、VEGF和PPAR-γ，PERK、eIF2a、IL-8、MCP-1和MIP-2A）,In situ hybridization and immunohistochemistry(gene expression of TNF-αreceptor,MMP1,MMP2,MMP9,MMP13,TIMP1,TIMP2, uPA,uPAR,PAI-1,PAI-2，caspase8,caspase3,caspase6,caspase7,caspase12）,Histopathology,TUNEL, proliferation and apoptosis of HBE and AECII by flow cytometry, Transmission electron microscopy, laser confocal microscopy technology, light and electron microscopic was used to observe tissue of lung and cell changes. Explore cellular and molecular mechanisms of Supplemental Er Chen Decoction on airway,alveolar walls and pulmonary vascular structure reconstruction in COPD, to provide the new thinking for clinical prevention and treatment of COPD in TCM and new targets.

本课题基于肺主肃降理论和COPD发病机制，在前期临床和实验研究得出以二陈汤为主的爱罗咳喘宁对COPD有效的基础上，制备COPD大鼠和细胞模型，采用ELISA、放射免疫法、蛋白印记法、RT-PCR（TGF-β1、TNF-α、ET-1、PPAR-γ、VEGF、VEGFR2、PERK、eIF2a，IL-8、MCP-1和MIP-2A mRNA）、Western-blot（uPA/PAI-1系统、VEGF和PPAR-γ，PERK、eIF2a、IL-8、MCP-1和MIP-2A蛋白水平）、组织病理学、原位杂交和免疫组化（MMPs、TIMP1、TIMP2，uPA/PAI-1系统，caspase8/3/6/7/12蛋白）、TUNEL和流式细胞仪、透视电镜、激光共聚焦等技术，选择多靶点、多维度系统探究二陈汤加味对COPD气道、肺泡壁及肺血管结构重建的机制，为中医药治疗COPD的新靶点提供新思路和实验依据。

本课题基于肺主肃降，采用香烟烟雾联合脂多糖制备慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠模型，以探讨二陈汤加味对COPD治疗效果及作用机制。应用二陈汤加味对大鼠模型进行干预后，观察大鼠一般情况，测定大鼠肺功能，采用ELISA法、实时荧光定量聚合酶链反应（PT-qPCR）、蛋白免疫印迹（Western blot）法，检测血清、支气管肺泡灌洗液、肺匀浆中的IL-8、TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18、IL-37、MCP-1、MPO、IL-10、IL-6、sICAM-1、TNF-α等细胞因子含量；IL-12/STAT4、IL-4/STAT6信号通路活化和诱导的IL-4、IFN-γ、Th1、Th2细胞分化；TLR4、β2AR、NF-kB、TRAF6、HMGB1、RAGE、PPARγ、CBP、P300的蛋白及基因表达；TGF-β1及其受体，PDGF-BB、MMP2、MMP9、uPA、uPAR、PAI-1和PAI-2、I型、III型胶原的蛋白及基因的表达；ET-1、VEGF、VEGFR2、Sirt1、SMAD2、SMAD3、SMAD7表达；P-STAT4、P-STAT6、GATA3、T-bet的蛋白及基因表达的变化；用TUNEL法检测细胞凋亡情况，检测PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路以及Sirt1/ORP150分子通路相关因子蛋白及基因表达情况，确定二陈汤加味含药血清对COPD中人支气管上皮细胞凋亡的干预作用，从细胞层面阐明二陈汤加味对治疗COPD的作用机制。.结果发现，二陈汤加味对COPD模型大鼠通过多种细胞信号转导通路发挥抗炎及免疫调节；对细支气管、肺间质、肺部血管结构重塑的抑制作用以及细胞和分子机制；从而发挥保护气道、肺的组织结构与功能。