辣椒素含量相关基因的挖掘、克隆与功能验证

Pepper is one of the most important vegetables, spices and industrial raw materials because of its unique pungency, and its capsaicinoids have medical and health uses, such as the anticancer, analgesia and amaigrissement. The linkage mapping and association analysis will be used to find SNPs associated with capsaicinoid content, which will be used to infer functional important genes for further analysis. First, the interspecific BA3 x YNXML F2 mapping population including the 297 F2 progenies and a high-density interspecific SNP genetic map constructed by previous research will be used for QTL/fine mapping. Second, an association panel of 399 diverse elite/landrace lines including the two aforementioned parents (BA3 and YNXML) will be used to identify major genes associated with capsaicinoid content or SNP loci through a genome wide association analysis (GWAS). Third, candidate genes will be analyzed systematically combining information of Zunla-1 and gene bank database using bioinformatics. We will clone the identified genes and analyze its expression. Moreover, we will take advantage of site-directed mutagenesis methods (i.e. CRISPR) to create knockout mutants of the gene of interest and further understand its biological function as well as the underlying molecular mechanism for capsaicin synthesis and accumulation. These studies will provide theoretical support and materials for molecular breeding of pepper with different pungency degree.

辣椒因独特的辛辣味成为重要的蔬菜、调味品和工业原料，并且辣椒素类物质具有抗癌、镇痛和减肥等医疗和保健作用。本研究同时采用连锁作图与关联分析策略，以包含297个单株的F2群体为作图群体，基于前期研究构建的高密度遗传连锁图谱，结合单环境鉴定的表型性状进行QTL/基因精细定位，发掘控制辣椒素含量的相关基因；以399份辣椒自交系和地方种为材料，利用全基因组关联分析，结合多环境鉴定出决定辣椒素含量的关键基因或SNP位点；结合比较基因组学和生物信息学等方法，结合一年生辣椒Zunla-1基因组序列和基因数据库，获得SNP标记所关联的候选基因，并对候选基因进行克隆和表达分析；利用CRISPR技术构建关键候选基因靶位点敲除载体，遗传表达重组获得突变体，结合生物化学和细胞生物学方法对其进行功能分析，初步明确其生物学功能及辣椒素生物合成和积累的分子调控机理。这些研究将为不同辣度辣椒的分子育种提供理论和材料支持。

辣度素含量是数量性状，其生物合成和积累的分子调控机理一直不清楚，挖掘与辣椒素含量相关的优良等位基因，阐述这些优良等位基因在辣椒素生物合成和积累的机理，并开发相应的功能标记，将为不同辣度辣椒的分子育种提供理论和材料支持。本研究基于供试材料辣椒素含量表型数据，进行全基因组关联分析和QTL定位，获得了20个关键SNP位点和11个辣椒素含量相关的主效QTLs；结合QTL和GWAS的结果，共获得5个控制辣椒素含量的候选基因，分别为pAMT、C4H、4CL、FatA和AT3；然后比较这些基因在辣度不同的辣椒中的基因型差异，其中AT3-D1和AT3-D2在CDS区都存在SNPs，这可能是一种与辣椒素积累相连的关键因素，可以决定不同品种辣椒的辣度；通过其他4个候选基因4CL、C4H、FatA和pAMT的序列进行测序和这些材料果实辣椒素含量的测定，分析发现仅有C4H的序列多态性差异（AGC-CGC或者AGC-TGC）与辣椒素含量变异有关联，初步确定为影响辣椒素含量的功能位点。为验证上述候选基因的功能，初步构建了辣椒素候选基因的验证体系，即利用辣椒自身的U6/U3启动子构建高效精准的靶向基因编辑载体和基因瞬时转化技术体系，为候选基因的功能验证奠定了技术基础。因此，与辣椒素含量变异有显著关联的pAMT、C4H、4CL、FatA 和AT3是辣椒素生物合成和积累的重要候选基因。该研究为辣椒素含量相关的候选基因的发现提供了理论依据和创新性研究成果。