家蝇免疫系统中LPS-LITAF-Eiger信号途径的鉴定

LITAF (LPS-induced TNF-α factor)是一种重要的转录因子，哺乳动物受到LPS的诱导后，LITAF可调节TNF-α的合成并参与免疫反应。Eiger是从果蝇体内发现的唯一TNF家族成员。无脊椎动物中是否存在LPS-LITAF-Eiger调控途径尚不清楚。本课题组通过家蝇幼虫转录组测序，筛选到了LITAF和Eiger基因的EST序列，并初步证实它们参与了家蝇抗菌免疫反应。本项目拟首先分析LITAF在家蝇体内的时空分布及亚细胞定位，以了解LITAF的表达模式。然后采用反向遗传学的方法，构建LITAF过表达和RNAi敲低细胞株，并建立家蝇LITAF敲低模型，检测LITAF对Eiger基因表达的影响。克隆Eiger基因启动子，通过报告基因和ChIP等技术验证LITAF结合元件，最终证实是否LITAF作为Eiger的转录因子对其进行调控，进而阐明二者在家蝇免疫系统中的作用。

LITAF (LPS-induced TNF-α factor)是一种重要的转录因子，哺乳动物受到LPS的诱导后，LITAF可调节TNF-α的合成并参与免疫反应。Eiger是从果蝇体内发现的唯一TNF家族成员。无脊椎动物中是否存在LPS-LITAF-Eiger调控途径尚不清楚。本项目成功克隆得到了家蝇Litaf和Eiger基因的全长cDNA序列。通过实时荧光定量检测结果显示MdLitaf基因在1龄幼虫期表达量最高，并在肠中表达量最大。在免疫感染以及热激前后家蝇体内MdLitaf基因的mRNA水平均发生显著性变化，应对革兰氏阳性、革兰氏阴性菌的侵染，在免疫刺激3 h表达迅速上调，在42℃热激1 h后，MdLitaf的表达量明显上调。通过免疫组化检测显示LITAF在血细胞，脂肪体，表皮以及肠道中均有表达。pEGFPN1-LITAF融合表达显示在Hela细胞主要分布于胞质中。RNAi敲低家蝇幼虫LITAF的表达后，Eiger基因表达随之被抑制，证明家蝇体内LPS-LITAF-Eiger表达调控通路的存在。家蝇幼虫RNAi敲低Eiger后，Eiger基因表达下调会使抗菌肽diptericin和attacin基因表达增强，敲低MdLitaf和MdEiger基因48 h后检测酚氧化酶活性，发现MdLitaf干扰组的酚氧化物酶的活性较对照组下降了53%，MdEiger干扰组同期下降了32.5%。采用Genome Walking技术，获得Eiger启动子及其上游的调控序列，通过生物信息学分析预测了启动子核心区域及上游调控元件。.项目基本按照拟定计划完成全部任务，发表学术论文9篇，其中SCI收录5篇。