一个66.2kD的小麦抗旱相关蛋白质基因的克隆及其功能标记开发

干旱造成小麦减产和生产成本增加的趋势日益严重，选育和推广抗旱品种是增加小麦产量和降低生产成本最经济、最有效的措施之一。但由于缺少适合育种早代微量、快速、有效的抗旱鉴定技术和方法，导致目前抗旱小麦品种选育的效率很低。.本课题组前期选用48份不同生态地区小麦品种，结合田间、温室与实验室多年研究，发现一个66.2 kD的水分胁迫应答蛋白与小麦品种抗旱性密切相关。本项目拟对该蛋白质进行深入研究，分离纯化测序，确定蛋白质组成；利用3'、5'-RACE和Genome walker等方法获得其基因的全长cDNA和启动子区序列，并进行功能验证；分析该基因在高抗与干旱高敏感材料间的等位变异，开发基因的功能标记，利用一个重组自交系群体确定基因的效应。为小麦抗旱分子机理研究和分子育种奠定基础，提高小麦抗旱育种的效率。

建立适合育种早代微量、快速、有效的抗旱鉴定技术和方法，是选育抗旱小麦新品种的基础。基于早期发现一个66.2 kD水分胁迫应答表达蛋白与小麦抗旱性有关的研究，本项目对其基因进行了克隆并开发了功能分子标记，达到了项目预期的结果。. 首先，在田间和旱棚连续两年试验，完成了150份小麦品种（系）和（晋麦47×西农2208）组合后代230份重组自交系的抗旱性鉴定，明确了这些材料的抗旱特性；在供水正常和干旱胁迫下，SDS-PAGE分析明确了品种（系）和群体后代66.2kD蛋白的表达；在小麦品种（系）和群体后代中，水分胁迫处理后表达此蛋白材料总体的平均抗旱指数极显著大于不表达此蛋白的材料（P＜0.01），表明此蛋白在水分胁迫后表达与小麦自身抗旱性密切相关。其次，结合电泳与质谱技术，分离和鉴定出了水分胁迫差异表达的蛋白26个；进一步选择在双向电泳中分离和鉴定出的分子量接近66.2 kD、且表达量上调的蛋白，作为进一步研究的候选蛋白。随后，结合RT-PCR和RACE等方法，克隆了全长cDNA，开放读码框由1734bp组成，编码577个氨基酸，理论分子量约为63.8 kD，结构预测蛋白属于硫氧还蛋白家族的1个新成员，由核基因编码。其基因组DNA全序列由4个外显子和3个内含子组合，通过两组抗旱性极端品种之间基因组序列差异分析发现，以第1内含子序列变异为最大，该基因存在两种等位变异类型TaNrxa和TaNrxb。依据第1内含子差异序列设计了特异性引物，开发出了4个显性互补的分子标记Tnrxa-1、Tnrxb-1、Tnrxa-2和Tnrxb-2。标记检测品种（系）和群体后代的TaNrxa基因型总体的平均抗旱指数极显著大于TaNrxb基因型（P＜0.01），说明开发的标记非常有效。. 筛选出了一批（极）强抗旱的小麦种质资源，首次发现了小麦体内核基因编码的硫氧还蛋白家族的1个新成员蛋白，并克隆了其基因，开发出了4个显性互补的功能分子标记，为进一步开展小麦抗旱理论研究和新品种选育奠定了基础，将有助于我国抗旱小麦新品种选育效率的提高。培养研究生5人，最终发表本研究相关论文6篇以上。