基于原生质体的乳源抗菌肽Casein31损伤枯草芽孢杆菌细胞膜的作用机制研究

Milk-derived antimicrobial peptides can inhibit the growth of various spoilage bacteria and thus are used as natural antimicrobials for food preservation. In the previous study, a novel antimicrobial peptide Casein31 was identified in raw milk with minimum inhibitory concentration against Bacillus Subtilis between 1.8 and 4μM. In the mechanism study, Casein31 can form pores on the bacterial membrane, leading to the membrane disruption and cell death. But how Casein31 forms pores and disrupts bacterial membrane are still unknown. In this project, circular dichroism, fluorescent probe technique, ultramicro-technique and X-ray diffraction technique will be applied to study the mechanism of Casein31 action on bacterial membrane: Firstly, the transition of secondary structure of casein31 during the insertion into bacterial membrane will be analyzed; Secondly, the interaction of Casein31 with main components of cell wall and the role of cell wall on the insertion of Casein31 into bacteria will be investigated; Finally, the alterations in membrane structure will be analyzed based on protoplast, including the interaction between Casein31 and bacterial membrane, thinning, pore formation and the location of pores, and the mechanism of membrane disruption by Casein31 will be elucidated. The result of this project will provides a basis for the designing and development of antimicrobial peptides and the application of Casein31 on food preservation.

乳源抗菌肽是一种新型的天然抗菌物质，能够抑制多种食品腐败菌的生长，在食品保藏中有广阔的应用前景。在前期研究中，本课题组首次从生牛乳中检测到一种新型抗菌肽Casein31（C31），对枯草芽孢杆菌有很强的抑制作用（最小抑菌浓度为1.8-4μM），能引起细胞膜结构损伤，进而导致细胞死亡，但损伤的机制尚未明确。本项目拟利用圆二色谱，荧光探针技术，超微技术和X-射线衍射技术研究C31对细胞膜的损伤机制：分析在枯草芽孢杆菌细胞表面的疏水环境诱导下，C31二级结构和两亲性的变化；明确细胞壁及其组分在C31入侵细胞过程中的作用；基于原生质体从动力学角度分析C31引起细胞膜结构损伤的过程，包括C31与细胞膜相互作用，细胞膜变薄，孔洞的形成和扩大的动态过程及位置分析，阐明C31损伤细胞膜的作用机制。本项目的研究将为抗菌肽的设计开发奠定理论基础，且为C31在食品保藏中的应用提供科学依据。

枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，广泛分布在土壤及腐败的有机物中，是自然界较为常见的食品腐败菌之一。抗菌肽由于其分子量小，抗菌谱广，不易产生耐药性，稳定性强，水溶性好，无免疫原性，对人体几乎无毒无副作用，可以被人体内的酶系降解、消化，因而可以用作一种新型的防腐剂，在食品保藏中发挥重要的作用。本项目采用圆二色谱技术，荧光探针技术和超微技术研究了Casein31引起枯草芽孢杆菌细胞膜结构损伤的作用机制：分析在枯草芽孢杆菌表面疏水环境诱导下Casein31二级结构的变化；明确Casein31与细胞壁各组分之间的相互作用以及细胞壁在Casein31入侵细胞过程中所起的作用；基于原生质体从动力学的角度分析Casein31引起枯草芽孢杆菌细胞膜结构损伤的过程。结果表明：第一，枯草芽孢杆菌细胞壁中的磷壁酸可以诱导乳源抗菌肽Casein31形成α-螺旋结构，肽聚糖对抗菌肽Casein31的二级结构影响较小，而细胞膜主要组分（包括双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油）能使Casein31的α-螺旋结构减少；在细胞层面上，完整枯草芽孢杆菌能诱导Casein31形成α-螺旋结构，而原生质体能诱导Casein31形成无规则卷曲结构。第二，抗菌肽Casein31可引起细菌细胞结构的明显塌陷、细胞膜破损，胞内物质外溢，从而引起细胞死亡。磷壁酸能显著减弱Casein31对枯草芽孢杆菌的抑菌作用，而肽聚糖对抑菌作用的影响较小。加入相同浓度Casein31的原生质体表面形成的孔洞小于完整细菌表面的孔洞。以上结果表明Casein31在枯草芽孢杆菌细胞壁上的作用位点为磷壁酸，并且细胞壁在一定程度上促进了细胞表面孔洞的形成。第三，抗菌肽Casein31的浓度与枯草芽孢杆菌原生质体表面孔洞直径扩大速率与成正相关，在25μg/ml Casein31作用20分钟后，原生质体表面的孔洞最大直径可以达到13 nm 以上。本课题为乳源抗菌肽的设计开发提供了理论基础，也为Casein31成为一类极具开发潜力的食品防腐剂提供科学依据。